无机化学中热力学研究论文提纲

论文题目：新型功能化DNA探针用于转录因子的荧光生物传感研究

摘要：转录因子（Transcription factors,TFs）是一类序列特异性DNA结合蛋白（DNA-binding proteins）,通过结合基因调控区域中特定的双链DNA序列（dsDNA）调控目标基因的转录。人类细胞中存在大约1400种转录因子。转录因子表达水平的正常变化对于细胞发育,分化和增长等细胞过程是必不可少的。但转录因子表达水平的异常变化将会导致发育障碍,异常激素反应,炎症和癌症等一系列疾病。它们的表达水平灵敏地反映细胞发展和疾病状态。因此,转录因子已被做为临床诊断和药物开发的潜在目标物。灵敏检测转录因子表达水平对于阐明基因调控机制,临床诊断和药物开发具有重要意义。转录因子的检测方法中,荧光检测方法具有操作简单、安全和灵敏度高的优势,获得广泛应用。其中,识别探针构象转变法是最常用的一种转录因子的荧光检测方法。此法是利用转录因子与识别探针发生特异性结合后,导致识别探针的构象发生改变,进而引起荧光信号的变化,实现对转录因子的检测,此法检测步骤简便、快速,但识别探针的设计较为复杂,应用范围受到限制。本论文以上述科学问题为研究目标,构建了2种多功能DNA探针,建立了2种解决方案。主要内容归纳如下：1.中性pH环境中Ag+稳定的自组装triplex DNA分子开关（Ag+-stabilized self-assembly triplex DNA molecular switch, Ag+-STDMS）用于转录因子的灵敏检测近年来,三螺旋DNA （triplex DNA）已被广泛应用于序列特异性标记,调控基因表达以及构建基于DNA的纳米结构领域。其中,包含C+·G（?）C和T·A（?）T（·代表Hoogsteen氢键,。代表Watson-Crick氢键）的triplex DNA最为常用。在triplex DNA的形成过程中,含有同型嘧啶链（胞嘧啶C和胸腺嘧啶T）的寡核苷酸（称之为triplex-forming oligonucleotides, TFO）需要质子化后才能结合双链DNA的嘌呤链（含有腺嘌呤A和鸟嘌呤G）,进而形成triplex DNA。因此,这种triplex DNA只能在弱酸性环境中形成及存在,极大地限制了它的应用范围。Ag+能够特异性地结合triplex DNA中的C+·G（?）C,并将C+·G（?）C中的H+置换形成Ag+O·G（?）C,使triplex DNA能够在中性及弱碱性环境中稳定存在,这极大拓宽了triplex DNA的应用领域。考虑到细胞中存在的许多转录因子的识别双链均富含G-C碱基对（例如,核转录因子NF-κB p50）,因此,我们构建了一种中性pH环境中Ag+稳定的自组装triplex DNA分子开关（Ag+-STDMS）,成功应用于NF-κB p50及实际生物样品的灵敏检测,检测限（LOD）分别为25 pM和0.8 ng/μL,优于现有的一些检测方法。此外,本文提出的检测方法检测步骤简便、快速。Ag+-STDMS易于设计,只要简单地改变相应的组成序列即可用于其它转录因子的灵敏检测,具有通用性。2.GO荧光开关辅助的多功能发夹探针（multifunctional G-quadruplex-hairpin probe, MGHP）用于转录因子的免标记、灵敏检测氧化石墨烯（GO）作为一种水溶性单原子厚度二维纳米材料,由于其独特的电子、机械和热力学性质,已经引起广泛关注。它能够通过非共价π-π堆叠相互作用吸附单链DNA,并能猝灭标记在单链DNA上的荧光团的荧光。与有机猝灭剂或其它纳米材料相比,GO具有优越的淬火效率,已被用于开发多种生物传感器。本文中我们利用GO的高效吸附作用和荧光猝灭属性,设计了一种具有三重功能（环部单链吸附于GO表面,茎部双链结合目标物转录因子,末端G四倍体作为信号载体）的发夹探针（MGHP）,构建了一种简单、免标记的荧光检测方法,实现了对NF-κB p50及实际样品的的灵敏检测,LOD分别为0.2 nM和7.8 ng/μL在疾病的早期阶段,转录因子显示相对较低的表达水平,因此,通过适当的信号放大技术对转录因子进行高灵敏检测对于疾病的早期诊断具有重要的现实意义。外切酶切割辅助扩增法是一种常用的转录因子的荧光放大检测方法。此法是利用外切酶（Exo Ⅰ、Exo Ⅲ）能够切割单链DNA、双链DNA的特性,当转录因子与识别探针结合形成复合物后,切割去除过量的识别探针。形成的复合物进入后续信号放大过程,实现转录因子的高灵敏检测。此法灵敏度高,但需要借助一种或两种外切酶切割去除过量的识别探针,切割不完全易引起假阳性信号。本论文以上述科学问题为研究目标进一步构建了2种多功能DNA探针,建立了2种解决方案。主要内容归纳如下：3.共区域化识别激活的级联链置换扩增用于转录因子的高灵敏检测结合诱导DNA链的共区域化,进而触发DNA组装已经引起广泛关注。其中,目标物结合触发的链置换是最常见的一种组装途径。在本文中,我们将目标物转录因子的识别序列分裂为三个小片段DNA,称之为分裂识别组件,构建一种转录因子的新型识别方式-共区域化识别。目标物识别三个分裂识别组件,使其发生共区域化,进而激活后续级联的链置换扩增和指数滚环扩增,实现了对NF-κBp50及实际样品的的高灵敏检测,LOD分别为0.25 pM和0.04 ng/μL,优于现有的大多数检测方法。更重要的是,反应中过量的分裂识别组分在试验温度（37℃）无法自行杂交成稳定双链结构进而引发后续的信号放大过程,因此,不需要任何外切酶的参与去切割过量的分裂识别组件,消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性信号。4.协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联链置换扩增用于转录因子的高灵敏检测碱基互补配对杂交是DNA的基本性质,具有互补碱基的单链DNA能够快速而彻底地配对杂交成为稳定的双链结构。无机化学中的掩蔽反应是最常用的去除杂质的手段。在本章中,我们将掩蔽效应应用于生物传感领域,设计了与识别探针互补的DNA掩蔽链,去除过量发夹识别探针,获得了较好的掩蔽效果,反应不需要任何外切酶的参与去切割过量的识别探针,消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性信号。同时利用目标物的结合保护效应,触发级联扩增,对NF-κB p50及实际样品进行高灵敏检测,LOD分别为0.1 pM和0.02

关键词：转录因子;triplex DNA;多功能发夹探针;共区域化识别;掩蔽效应;链置换扩增

学科专业：分析化学

摘要

ABSTRACT

符号与缩写

第一章 绪论

1.1 转录因子概述

1.1.1 转录因子的定义、作用机制及检测意义

1.1.2 转录因子的传统检测方法

1.1.3 转录因子的新型检测方法

1.1.3.1 无外切酶辅助的识别探针构象转变法

1.1.3.2 外切酶辅助的识别探针构象转变法

1.1.3.3 外切酶切割辅助扩增法

1.2 三螺旋DNA(Triplex DNA)的组成及其应用

1.2.1 Triplex DNA的组成

1.2.2 Triplex DNA的应用

1.3 共区域化的原理及应用

1.3.1 共区域化的原理

1.3.2 共区域化的应用

1.4 本论文的创新点以及研究内容

1.4.1 创新点

1.4.2 研究内容

1.5 参考文献

第二章 Ag~+稳定的自组装triplex DNA分子开关用于转录因子的灵敏检测

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 仪器

2.2.2 材料与试剂

2.2.3 实验步骤

2.2.3.1 DNA的分装、储存及工作溶液的配制

2.2.3.2 Ag~+-STDMS的构建及其与目标物NF-κB p50的结合反应、荧光强度的的测定

2.2.3.3 triplex DNA及Ag~+-STDMS的UV熔解曲线的测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 Ag~+-STDMS用于转录因子的灵敏检测的可行性研究

2.3.2 反应条件的优化

2.3.2.1 Ag~+浓度的优化

2.3.2.2 BHQ-1-TFO长度的优化

2.3.2.3 BHQ-1-TFO浓度的优化

2.3.2.4 pH的优化

2.3.3 检测方法的分析性能

2.3.3.1 荧光强度对不同浓度目标物的响应以及线性范围的确定

2.3.3.2 精密度和重现性的考察

2.3.3.3 特异性考察

2.3.3.4 实际样品测定

2.4 结论

2.5 参考文献

第三章 基于GO荧光开关的多功能G四倍体发夹探针用于转录因子的免标记、灵敏检测

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 仪器装置

3.2.2 材料与试剂

3.3 实验步骤

3.3.1 DNA的分装、储存及工作溶液的配制

3.3.2 MGHP在GO表面的吸附、复合物的解离、NMM的插入及荧光测定

3.3.3 反应过程的聚丙烯酰胺电泳表征

3.4 结果与讨论

3.4.1 基于GO荧光开关的MGHP用于转录因子的免标记灵敏检测的可行性研究

3.4.2 实验条件的优化

3.4.2.1 MGHP环部长度的优化

3.4.2.2 MGHP末端信号载体长度的优化

3.4.2.3 GO浓度的优化

3.4.2.4 GO猝灭时间的优化

3.4.2.5 目标物结合时间的优化

3.4.2.6 NMM浓度的优化

3.4.3 检测方法的分析性能

3.4.3.1 线性范围的确定

3.4.3.2 特异性考察

3.4.3.3 精密度和重现性考察

3.4.3.4 抑制效应考察

3.4.3.5 实际样品的测定

3.5 结论

3.6 参考文献

第四章 共区域化识别激活的级联信号放大用于转录因子的高灵敏检测

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 仪器装置

4.2.2 材料与试剂

4.2.3 实验步骤

4.2.3.1 高压灭菌

4.2.3.2 DNA的分装、储存及工作溶液的配制

4.2.3.3 共区域化识别激活的级联信号放大及荧光测定

4.3 结果与讨论

4.3.1 共区域化识别激活的级联信号放大用于转录因子的高灵敏检测的可行性

4.3.2 实验条件的优化

4.3.2.1 链置换辅助序列的筛选

4.3.2.2 目标物结合时间的优化

4.3.2.3 指数滚环扩增(ERCA)时间的优化

4.3.2.4 环状模板浓度的优化

4.3.2.5 Phi29 DNA polymerase用量的优化

4.3.3 检测方法的分析性能

4.3.3.1 线性范围的确定

4.3.3.2 特异性考察

4.3.3.3 精密度和重现性考察

4.3.3.4 抑制效应考察

4.3.3.5 回收率测定

4.3.3.6 实际样品的测定

4.4 结论

4.5 参考文献

第五章 协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大用于转录因子的高灵敏检测

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 仪器装置

5.2.2 材料与试剂

5.2.3 实验步骤

5.2.3.1 高压灭菌

5.2.3.2 DNA的分装、储存及工作溶液的配制

5.2.3.3 协同的的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大及荧光测定

5.3 结果与讨论

5.3.1 协同的的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大高灵敏检测转录因子的可行性研究

5.3.2 实验条件的优化

5.3.2.1 掩蔽链的优化

5.3.2.2 掩蔽时间的优化

5.3.2.3 目标物结合时间的优化

5.3.2.4 ERCA时间的优化

5.3.3 检测方法的分析性能

5.3.3.1 线性范围的确定

5.3.3.2 特异性考察

5.3.3.3 精密度和重现性考察

5.3.3.4 抑制效应考察

5.3.3.5 回收率测定

5.3.3.6 实际样品的测定

5.4 结论

5.5 参考文献

致谢

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