遗传学的法医学鉴定论文提纲

论文题目：NGS-SNPs体系对肿瘤组织个体识别的法医学应用研究

摘要：肿瘤组织溯源鉴定是国内外肿瘤临床工作中经常遇到的难题。肿瘤患者与被切除肿瘤组织的同一性识别对肿瘤患者的准确诊断及精准治疗的实施尤其重要。恶性肿瘤高发,肿瘤组织错误标记、混淆和污染的情况在医院病理科时有发生,这不仅导致医疗纠纷的发生,影响医院的正常运行,甚至困扰肿瘤病人的治疗,影响肿瘤临床医学的发展。随着肿瘤发病率和死亡率的增高,涉及肿瘤组织的法医学鉴定案件也越来越多。目前,已有大量研究报道在肿瘤组织中法医学常用的短串联重复序列（short tandem repeats,STRs）易发生突变,使同一个体正常组织和肿瘤组织的STRs基因型不一致,得出错误的排除性结论。在本实验室对多个系统肿瘤组织STRs的检测结果也证实这一现象。因此,需要检测突变率低的遗传标记进行肿瘤组织个体识别。与STRs相比,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）突变率低(～10-8)和扩增片段短（～100bp）的特点使其更适用于肿瘤组织法医学鉴定。然而,由于SNPs的二等位基因现象,需要检测大量SNPs位点才能获得与STR相似的效能,达到个体识别的目的。下一代测序（next generation sequencing,NGS）技术具有高通量性,能够同时检测几个样本的几百个SNPs位点,获得更高的个体识别效能。本研究用NGS技术检测肿瘤组织SNPs位点,探索肿瘤组织SNPs突变规律,为肿瘤组织法医学个体识别提供新的思路和方法。第一部分Precision ID Identity Panel在Ion Torrent PGM平台的测序评估目的:对NGS-SNPs体系进行实验室验证性评估。方法:提取采集的肿瘤患者正常对照组织DNA并定量,用Precision ID Identity Panel进行文库构建,包括4个主要步骤:扩增基因组DNA目的区域,部分消化引物序列,连接DNA条码并纯化,以及文库定量。将文库等体积混合后,进行模板制备和测序,具体过程按试剂盒说明书操作。测序完成后用Ion Torrent Suite Server v5.0.2进行数据处理,用HID＿SNP＿Genotyper v4.3.2插件进行SNPs分型。对体系的评估包括基因座覆盖度均衡、基因座链均衡、等位基因均衡和背景噪音。用对照DNA2800M重复测序3次并与其他实验室检测结果比对,验证NGS-SNPs体系的分型准确性和可重复性。用正常组织基因型数据调查河北汉族人群NGS-SNPs体系的群体遗传学数据,为该体系的应用提供基础。结果:基因座覆盖度均衡方面,常染色体SNPs平均基因座覆盖度约为Y染色体SNPs基因座的2倍。在常染色体基因座,5个SNPs基因座平均覆盖度超出均数±2SD范围;在Y染色体基因座,1个SNP基因座平均覆盖度超出均数±2SD范围。基因座链均衡方面,基因座链均衡平均值为0.50±0.06,以0.50±0.20为阈值,2个SNPs基因座表现出基因座链不均衡。等位基因均衡方面,所有纯和子基因型主要等位基因reads数频率＞90%,大部分杂合子基因型主要等位基因reads数频率＞50%且＜60%,5个SNPs rs7520386、rs876724、rs214955、rs917118和rs430046基因座存在杂合性不均衡,其平均杂合性均衡比分别为0.30、0.60、0.59、0.59和0.65。背景噪音方面,突变等位基因纯合子的背景噪音显著高于参照等位基因纯合子和杂合子,不准确等位基因是背景噪音的主要组成。对基因型的质量检测标识以覆盖度低（COV,41.08%）和链不均衡（PPC,32.99%）为主。2800M的3次分型结果以及与其他实验室报道的基因座分型结果一致。90个常染色体SNPs位点,低等位基因频率最小为0.083,最大为0.490,显示有的位点在河北汉族人群中多态性低。经Bonferroni校正,常染色体SNPs基因座均符合哈温平衡,处于连锁平衡状态。90个常染色体SNPs在河北汉族人群的累积个体识别概率为1-2.568×10-34,三联体亲缘鉴定的累积非父排除概率为0.99999993,二联体亲缘鉴定的累积非父排除概率为0.99990027。在73个男性样本中观察到8种Y-SNPs单倍型,形成8个单倍群,按观察次数分别为O3、N、O2、C、Q、O、D、E。第二部分NGS-SNPs体系检测肿瘤组织SNPs分型目的:用NGS-SNPs体系检测肿瘤组织SNPs分型,发现肿瘤组织中SNPs突变规律,探讨NGS-SNPs体系在肿瘤组织法医学个体识别中的应用。方法:提取肿瘤组织DNA、定量,进行文库构建、模板制备和测序,具体过程按试剂盒说明书操作。测序完成后数据处理过程同第一部分。分析肿瘤组织的基因座覆盖度均衡、基因座链均衡、等位基因均衡和背景噪音与正常组织的差异。比对肿瘤组织SNPs分型与正常组织SNPs分型,发现肿瘤组织SNPs基因型突变。以等位基因频率为基础按照二项分布方法,模拟该体系的无挂个体对、亲子对和全同胞对。分别计数肿瘤-正常组织对、无关个体对、亲子对和全同胞对的全不同基因座数（A0）、半相同基因座数（A1）、全相同基因座数（A2）和IBS评分。结果:1. 肿瘤组织与正常组织测序数据质量比较肿瘤组织的各基因座平均覆盖度趋势与正常组织一致,肿瘤组织的基因座平均覆盖度略高于正常组织,3个常染色体SNPs基因座平均覆盖度超过均数±2SD范围,1个Y-SNPs基因座平均覆盖度超过均数±2SD范围。肿瘤组织的基因座链均衡与正常组织链均衡无显著差异,存在链不均衡的SNPs位点与正常组织一致。肿瘤组织的主要等位基因reads数频率与正常组织存在显著差异,表现在杂合子的杂合性均衡方面。肿瘤组织纯合子的主要等位基因reads数频率＞90%,杂合子的主要等位基因reads数频率散在分布于50%～90%范围,所有SNPs位点均有基因型存在杂合性不均衡。在基因型质量检测中,以主要等位基因频率（MAF,58.51%）为主,存在少数COV（11.63%）和PPC（16.96%）。背景噪音方面,大部分基因座的背景噪音在肿瘤组织与正常组织变化较小,只有少数几个基因座的背景噪音变化突出,如SNPs rs1355336、rs938283、rs733164。2.应用NGS-SNPs进行肿瘤组织法医学个体识别策略的建立与正常组织相比,肿瘤组织常染色体SNPs只存在杂合性丢失一种突变类型。Y-SNPs未见突变。根据A0、A1、A2和IBS评分在肿瘤-正常组织对、无关个体对、亲子对和全同胞对的分布,以A2=67作为排除肿瘤组织与无关个体的阈值,A2=88作为认定肿瘤组织与身源个体的阈值;以IBS=157作为排除肿瘤组织与无关个体的阈值,以IBS=178作为认定肿瘤组织与身源个体的阈值。进一步分析突变的基因型发现,这些基因型在肿瘤组织中的主要等位基因频率reads数均为90%-95%,而Sanger验证结果显示这些位点均为杂合子,两个等位基因峰高相差较大。因此,将肿瘤组织纯合子和杂合子分型的阈值设定为95%,可以提高分型的准确性,需要Sanger测序验证。NGS-SNPs能够忠实反映检测混合样本的DNA组成,基于肿瘤组织中肿瘤细胞与间质细胞比例和测序主要等位基因reads数频率之间的规律,我们提出了一个用NGS-SNPs体系进行肿瘤组织法医学个体识别策略:首先,确定肿瘤组织中间质百分比;其次,对肿瘤组织和正常对照样本进行DNA提取、定量和NGS检测SNP分型,肿瘤组织DNA平行测序2次;然后,分别检查和确定正常对照样本和肿瘤组织的基因型,需要注意间质百分比＜30%的肿瘤组织,当存在纯合子FMAR值在两次测序结果均为90%-95%时,判定该基因座为杂合子;最后比对肿瘤组织与正常对照样本基因型,一致,则支持两个样本来源于同一个体,不一致,则不支持两个样本来源于同一个体。对于间质百分比＜10%的肿瘤组织,可能出现突变纯合子的FMAR值≥95%,对存在不一致分型的位点,用Sanger测序验证,应用A2和IBS评分进行身源判定。第三部分NGS-SNPs体系检测肿瘤患者来源检材的应用性验证研究目的:针对肿瘤患者来源检材,探讨NGS-SNPs体系的可应用性,并调查该体系在河北汉族人群的群体遗传学数据,为其应用提供基础。方法:用NGS-SNPs体系检测不同起始量2800M进行灵敏度检验,以确定最低DNA起始量,为微量检材的检验提供参考。用NGS-SNPs体系检测肿瘤患者外周血液DNA,以确定循环DNA对基因分型的影响,为实践中对肿瘤患者外周血液检测提供指导。用Gene Read DNA FFPE Kit提取福尔马林固定组织DNA,以观察福尔马林固定对DNA分型的影响,为实践中提取蜡块组织DNA提供方法指导。用NGS-SNPs体系检测不同降解程度DNA,以检测该体系对降解检材的检测能力。检测1例肿瘤组织个体识别案件,验证NGS-SNPs体系进行肿瘤组织法医学个体识别的应用性。结果:1.当起始DNA量低于50pg时,基因座覆盖度均衡、基因座链均衡和杂合性均衡表现不佳,而且发生基因座丢失、等位基因掺入和等位基因丢失。当DNA起始量为100pg时,可以检测到完整、准确的基因型,建议最低DNA起始量＞100pg。由于DNA起始量低影响分型准确性,建议最佳DNA起始量为200pg～1ng。2. 肿瘤患者外周血液的基因分型与正常组织的基因分型完全一致,因此肿瘤患者的外周血液可以作为正常检材用于实践。3. 用Gene Read DNA FFPE Kit提取的福尔马林固定组织DNA未检测到福尔马林固定导致的人为突变对SNPs分型的影响,因此建议实际检案中用Gene Read DNA FFPE Kit试剂盒提取肿瘤组织蜡块DNA。4. NGS-SNPs体系对降解系数为1～10的轻度和中度降解检材的检出率为100%,显著优于CE-STR。对中度降解的检材需要增加起始DNA模板量提高检测成功率。对重度降解检材的检测能力存在局限性。5. 对1例肿瘤组织个体识别案件用NGS-SNPs体系进行检验,肿瘤组织SNPs基因型与被鉴定人外周血液样本SNPs基因型完全一致,支持肿瘤组织来自被鉴定人。结论:Precision ID Identity Panel结合Ion PGM测序平台在本实验表现良好,分型准确可靠,对一些基因座进行调整和改善可以使体系更趋完善。肿瘤组织SNPs只发现杂合性丢失一种突变类型,基因突变使得肿瘤组织的背景噪音、主要等位基因reads数频率与正常组织存在显著差异。基于肿瘤细胞与间质细胞的比例和测序结果的主要等位基因reads数频率的规律,本研究提出一种应用NGS-SNPs体系进行肿瘤组织法医学个体识别的新策略,经验证该策略具有可行性,为解决肿瘤组织法医学个体识别鉴定案件提供新的思路和依据。

关键词：NGS-SNPs;肿瘤患者来源检材;突变;身源鉴定;法医遗传学

学科专业：法医学

中文摘要

Abstract

英文缩写

引言

第一部分 Precision ID Identity Panel在Ion Torrent PGM~(TM)平台的测序评估

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 NGS-SNPs体系检测肿瘤组织SNPs分型

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 NGS-SNPs体系检测肿瘤患者来源检材的应用性验证研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 下一代测序技术在法医学的应用进展

参考文献

致谢