肝癌的表观遗传学研究进展

摘要：表观遗传学是指基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。表观遗传修饰异常广泛存在于肿瘤的发生、发展过程中，近年来备受研究者的关注。在肝癌的发病机制研究中，表观遗传学的研究越来越受到学者重视：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等表观特征的异常导致肝细胞中癌基因或者抑癌基因表达异常，进而参与了肝癌的发生发展;而非编码RNAs则以特殊的调控方式参与表观遗传调控过程，进而参与肝癌的发生发展过程。本文阐述肝癌发生发展过程中的表观遗传修饰的研究状况。

关键词：肝癌;表观遗传学;DNA甲基化;组蛋白修饰;染色质重塑;非编码RNAs;N6-腺苷酸甲基化

2020年全球癌症报告显示肝癌的发病率位居世界肿瘤发病率第七位(2018全球癌症数据统计为第六位)，死亡率位居世界肿瘤死亡率第三位(2018全球癌症数据统计为第四位)[1]。在我国，国家癌症中心发布的2019年全国癌症报告(全国癌症中心肿瘤登记数据一般滞后3年)显示，2015年肝癌总发病率为9.42%，位居全国第四位;以性别区分，肝癌在男性中的发病率为12.74%，居男性肿瘤第三位;女性中的发病率为5.40%，位居第七位;以区域划分，肝癌位居城市发病率第四位，农村发病率第三位。肝癌在我国和全球范围内仍然是巨大的健康隐患。因此，肝癌的发病机制研究和基于发病机制的药物研发迫在眉睫。

原发性肝癌包括肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)(占比75%~85%)、肝内胆管癌(占比10%~15%)和其他类型的肝癌，其主要危险因素包括乙肝病毒和丙肝病毒感染、黄曲霉毒素、重度饮酒、肥胖和2型糖尿病等[2]，而发病机制研究涉及基因组、转录组、蛋白质组、代谢等各个方面。表观遗传调控可介导基因转录、蛋白质表达甚至代谢过程，但不会改变基因组的遗传调控方式。研究肝癌中表观遗传研究进展在预测治疗肝癌的药物反应或预后个体中的差异，筛选适合患者个体的药物、剂量和治疗方式方面均具有重要意义。

表观遗传学是指在DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。1942年沃丁顿在Endeavour杂志中首次提出表观遗传学。基因型的遗传或传承是遗传学研究的主旨，而基因型产生表型的过程则属于表观遗传学研究的范畴。表观遗传包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码RNA调控等，主要通过对基因转录或翻译过程的调控，影响其功能和特性。实际来讲，m6A甲基化也属于表观遗传研究范畴。本文着重阐述了肝癌发生发展中的DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNAs和RNA甲基化修饰的m6A甲基化等相关作用研究进展。

1

DNA甲基化是目前研究得最清楚，也是最重要的表观遗传修饰形式之一，主要指基因组DNA上胞嘧啶的第5位碳原子和甲基间的共价结合，由此被修饰为5-甲基胞嘧啶。基因启动子区CpG岛甲基化水平的变化可通过调控基因转录影响基因表达，高甲基化的CpG岛会稳定核小体之间的紧密结合而抑制基因的表达。在肿瘤的发生发展中，一般来说，抑癌基因的启动子区通常甲基化水平升高，癌基因的启动子区则甲基化水平降低。

DNA甲基化受肿瘤微环境影响最大，而肿瘤微环境常常和肿瘤患者自身状态密切相关，具有个体差异，是肿瘤异质性发展的重要原因之一。

DNA甲基化在肝癌的发展中发挥了重要的调控作用，肝癌细胞可通过甲基化修饰的方式调控癌基因或者抑癌基因的表达。(1)在肝癌整体甲基化图谱研究中通过对646例肝癌和134例正常肝组织中的整体启动子甲基化比较分析，筛选发现222个表观驱动基因的462个启动子位点的甲基化水平与基因表达负相关，证实了肝癌中基因甲基化的改变可能驱动肝癌的发生，可作为肝癌诊疗的生物标志物[3]。(2)在非酒精性脂肪性肝炎引发的肝癌整体甲基化图谱研究中，通过对264例肝组织样本(113份非酒精性脂肪性肝炎组织、55例正常肝组织、37份显示慢性肝炎或肝硬化并伴有HBV或HCV感染的非癌性肝组织样本、37份伴有HBV或HCV感染肝癌组织、22例非酒精性脂肪性肝炎相关的肝癌组织)进行单CpG分辨率全基因组DNA甲基化分析，发现WHSC1的DNA低甲基化和WDR6基因的DNA高甲基化可能参与非酒精性脂肪性肝炎相关的肝癌发生[4]。(3)DNA甲基化与肝癌药物研究。研究发现，DNA甲基化驱动的上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是肝癌患者对索拉非尼产生耐药的基础之一，检测血液中EMT相关基因CpG岛的甲基化状态可以作为肝癌患者对索拉非尼产生耐药的预测标志[5]。为了克服肝癌治疗药物的副作用和有限的疗效，人们需要不断确定更有效的药物靶点和进行作用机制研究。近年来，表观遗传修饰剂已被公认为肝癌的重要治疗靶点，因为它们在体内和体外均具有抑制肝癌转移和增殖的能力。在DNA甲基化研究层面，许多研究表明DNA甲基转移酶(DNAmethyl-transferases,DNMTs)介导的表观遗传学改变调节着肝癌的转移、侵袭、发生和发展，未来也可针对DNMTs家族研究开发新的表观遗传修饰剂[6-7]。

2

组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修饰的过程。在肿瘤研究中，组蛋白修饰研究主要集中在组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等。(1)组蛋白甲基化主要发生在H3、H4的Lys和Asp残基上，可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这取决于被修饰的位置和程度;(2)组蛋白乙酰化一般与活化的染色质构型相关联，乙酰化修饰大多发生在组蛋白H3、H4的Lys残基上;(3)组蛋白磷酸化的发生主要在组蛋白的Ser残基，一般与基因活化相关;(4)组蛋白泛素化一般是C端Lys修饰，启动基因表达。

在肝癌研究中，组蛋白修饰的异常同样可导致肝癌的发生发展。BORIS可通过结合在OCT4的启动子区介导H3K4二甲基化修饰增加、H3K27三甲基化修饰减少，从而上调OCT4表达促进人肝癌细胞的肿瘤干性[8]。组蛋白H3K9甲基转移酶SETDB1除了调控组蛋白的甲基化水平，也可以通过调控p53的K370me2水平调控肝癌细胞的生长[9];同样，组蛋白H3K9甲基转移酶G9a可以通过调控RARRES3组蛋白的H3K9二甲基化水平促进肝癌的增殖和转移[10];HBV相关肝癌中，HBV通过调控DLL3启动子组蛋白乙酰化参与肝癌的发生发展过程[11];组蛋白H4乙酰化介导的Ikaros启动子反式激活和Ikaros介导的组蛋白H4乙酰化反式激活的正反馈调节调控AZGP1的表达参与肝癌细胞的转移和侵袭[12];MTA1通过降低组蛋白簇1H1家族成员c(H1.2)的磷酸化水平促进肝癌的发展进程[13];药物研发中一些药物通过抑制组蛋白H3的磷酸化水平达到治疗肝癌的目的[14-15];TRAF6可通过结合HDAC3并和泛素化作用调控c-Myc的表达促进肝癌的发生[16];HBx通过结合PARP1阻断PARP1与SIRT6的结合，影响SIRT6催化DNA修复所需的单ADP核糖化过程，进而导致肝癌的发生[17]。

3

染色质重塑是由染色质重塑复合物介导的一系列以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程，主要通过调整核小体的相位，中和组蛋白尾巴碱性氨基酸残基(赖氨酸K、精氨酸R、组氨酸H等)所带正电荷，减弱核小体中碱性氨基酸与DNA的结合，降低相邻核小体间的聚集使核小体滑动暴露本来被遮蔽的元件，或使核小体表面的元件瞬间暴露(如暴露基因转录启动子区中的顺式作用元件)。

染色质重塑的过程主要有两类酶参与：组蛋白修饰因子和ATP依赖的染色质重塑因子。组蛋白修饰因子完成基因调控过程中涉及到组蛋白修饰的发生：甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等，由组蛋白乙酰化酶、组蛋白去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶负责H2A/H2B泛素化与去泛素化酶等组成;ATP依赖的染色质重塑因子则至少可分为五类：SWI/SNF家族复合体、ISWI家族复合体、CHD家族复合体、INO80家族复合体、SWR1。实际上，这些组蛋白修饰因子和染色体重塑因子在肝癌中的异常表达通常可导致染色质重塑的异常进而参与肝癌的发生发展。

肝癌中高表达的组蛋白乙酰转移酶hMOF通过影响染色质重塑导致某些关键基因的转录激活促进肝癌的血管浸润[18];组蛋白乙酰转移酶HAT1在肝癌中异常高表达，通过促进肝癌细胞的糖酵解促进肝癌的发生[19];肝癌中表达上调的组蛋白去乙酰化酶HDAC4通过形成HDAC4/SP1/miR-200a的调控网络导致染色质重塑过程的异常[20];组蛋白甲基转移酶SETDB1在肝癌中的异常高表达促进了肝癌的增殖和转移[21-22];在肝癌中高表达的组蛋白去甲基化酶KDM3B可调控肝癌细胞中的周期相关基因[23];BRG1是ATP依赖的染色质重塑复合物SWI/SNF的一部分，其在肝癌中高表达，通过调控SMAD6促进肝癌细胞的增殖[24];SWI/SNF复合物另外的一个亚基SMARCD1同样在肝癌中异常高表达，可促进肝癌的增殖[25];INO80在肝癌中高表达，其通过与lncRNAHAND2-AS1结合发生染色质定位的改变而参与肝癌的发生发展[26]。综上，表明染色体重塑在肝癌发生发展中有着重要的作用和研究价值。

4

除了上述提及的肝癌中经典的表观遗传研究包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑外，有另外的一类分子被证实在表观遗传调控中同样发挥重要的调控作用，这类分子即为非编码RNAs，其中研究比较多的为长链非编码RNAs(longnoncodingRNAs,lncRNAs)、微小RNAs(microRNAs,miRNAs)、部分环状RNAs(circularRNAs,circRNAs，有些circRNAs也被证实可以翻译成蛋白质)。这里将重点阐述这些非编码RNAs在肝癌的表观遗传调控中的作用。

4.1LncRNAs与肝癌

LncRNAs是一类长度大于200个核苷酸、没有编码蛋白质能力的转录本，曾被称为“转录噪音”，不具备实际功能，但随着后基因组学研究的深入，发现lncRNAs具备很强的调控功能，尤其在肿瘤的发生发展过程中，异常表达的lncRNAs可以通过不同的作用方式调控相关基因的表达，因此，lncRNAs是基因表观遗传调控中的重要调控因子。

LncRNAs调控基因表达的主要作用方式：(1)lncRNAs的转录会抑制或者激活临近基因的表达;(2)lncRNAs通过互补配对的方式结合靶mRNAs，影响靶mRNAs的剪接、翻译和稳定性;(3)lnc-RNAs可以通过结合蛋白质分子，作为蛋白复合体形成的支架，影响蛋白质的稳定性、蛋白质的修饰等;(4)lncRNAs可以发挥miRNAs海绵吸附体功能，通过吸附miRNAs与靶基因行使ceRNA调控机制;(5)定位于细胞核内的lncRNAs可以通过结合转录因子、染色质修饰复合物、组蛋白修饰因子、染色质重塑子等发挥表观遗传调控作用。

LncRNAs可通过不同机制影响肝癌的发生发展。HAND2-AS1通过与染色质重塑子INO80复合体结合定位到BMPR1A启动子诱导其表达进而激活BMP信号通路参与肝癌的发生[26]。lncTCF7通过招募SWI/SNF家族复合体至TCF7启动子区激活WNT信号通路促进肝癌干细胞的致瘤活性[27]。lnc-RNACASC9结合染色质修饰复合物HNRNPL在肝癌中调控AKT信号通路活性以及对DNA损伤的敏感性[28]。lncRNATUG1通过结合多梳抑制复合体2(polycombrepressivecomplex2,PRC2)招募至KLF2启动子区促进组蛋白发生H3K27三甲基化来使其表达沉默，进而参与肝癌的增殖[29]。肝癌中高表达的lncRNAHEIH通过结合H3K27三甲基转移酶EZH2招募至相关基因的启动子区抑制相关基因的表达而参与肝癌的发生发展[30]。Linc-GALH通过调控DNMT1泛素化水平进而调控Gankyrin启动子的甲基化水平参与肝癌的转移过程[31]。lncRNADLEU2结合HBx蛋白对HBV病毒的cccDNA和宿主靶基因发挥表观遗传调控作用促进HBV相关肝癌的发生[32]。这些研究表明，lncRNAs会参与肝癌发生发展过程中的表观遗传调控过程。

CircRNAs与肝癌

CircRNAs也是RNA领域最新的研究热点，circ-RNAs与传统的线性RNA不同，不含5′和3′末端，呈现封闭环状结构;circRNAs不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。CircRNAs已被证实在多种肿瘤中发挥重要的调控作用。目前证实circ-RNAs调控基因表达的主要作用机制为：(1)circ-RNAs行使海绵吸附体作用吸附miRNAs对下游靶基因进行调控;(2)circRNAs也可以与蛋白质结合影响蛋白质的功能。

CircRNAs如何在肝癌的发生发展过程中发挥表观遗传调控的作用?最新的研究发现：在肝癌中高表达的circRHOT1通过结合乙酰基转移酶TIP60招募至NR2F6启动子区抑制NR2F6的表达促进肝癌的增殖和转移[33];circ-ADD3能够增强CDK1和EZH2之间的相互作用，导致EZH2泛素化增加，随后通过苏氨酸-345和苏氨酸-487位点的磷酸化降解的机制抑制肝癌的转移[34];同时hsa_circ_0103809和Circ-ZEB1.33分别通过吸附miRNA的方式调控了转录因子SOX2和CDK6而参与肝癌的发生发展过程[35-36]。

MiRNAs与肝癌

MiRNAs是真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长度为20~25个核苷酸，一般在转录后水平参与基因的表达调控。MiRNAs的调控机制一度被认为“单一”：通过与编码基因mRNA的3′UTR结合抑制蛋白质翻译。但随着ln-cRNAs和circRNAs的研究深入，发现lncRNAs和circRNAs在行使ceRNA调控机制时需要miRNAs的介导，同时也证实miRNAs发挥功能时不仅结合在编码基因的3′UTR，还可以结合在转录本(编码基因和lncRNAs、circRNAs)的任意区域发挥作用。

MiRNAs如何在肝癌的发生发展过程中发挥表观遗传调控的作用?相关的研究发现，在HBV相关的肝癌中microRNA-152通过靶向DNMT1导致整体甲基化水平发生异常[37];miRNA-29a通过抑制DNMT3B和DNMT1的翻译参与TGFβ诱导的肝细胞癌上皮间质转化[38];miRNA-494是多重侵袭抑制性miRNAs中的主要表观遗传调控因子，在侵袭性肝癌中通过靶向DNA甲基化羟化酶TET1发挥作用[39]。miRNA-221调控肿瘤抑制因子HDAC6(组蛋白去乙酰化酶6)促进肝癌的恶性进展[40]。这些研究证明miRNAs也可以在肝癌的发生发展过程中发挥表观遗传调控的作用。

非编码RNA在肝癌中的作用并不是单一的，lncRNA、circRNA和miRNA往往形成网络调控作用，目前研究最多的是lncRNA和circRNA作为miRNA的“吸附海绵”影响整个生理病理过程。在肝癌非编码RNA研究中也存在大量的lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA(内源性竞争性抑制作用)调控网络，并逐渐成为肝癌发病机制的重要组成部分之一[41]。

5

RNA甲基化是目前表观遗传研究的热度方向之一。除了我们熟悉的DNA甲基化外，RNA本身也存在很多修饰，其中RNA甲基化约占所有RNA修饰的60%以上。RNA最常见的内部修饰包括N6-腺苷酸甲基化(m6A)、N1-腺苷酸甲基化(m1A)、胞嘧啶羟基化(m5C)等。其中N6-腺苷酸甲基化(m6A)是最为普遍的修饰。参与m6A过程的酶分子包括去甲基化酶、甲基化酶和甲基化识别酶等。一旦参与m6A修饰的酶出现异常将会引起一系列疾病，包括肿瘤、神经性疾病、胚胎发育迟缓等。

目前肝癌中的m6A研究进展主要包括：肝癌中异常高表达m6A甲基转移酶METTL3通过YTHDF2(甲基化识别酶)依赖的SOCS2转录后沉默促进肝癌进展[42];m6A甲基转移酶METTL14通过调节相关miRNAs前体的m6A甲基化水平抑制肝细胞癌的转移潜能[43];甲基转移酶复合物成分之一KIAA1429通过调控GATA3转录后的m6A修饰促进肝癌的进展[44];甲基转移酶复合物的其他成分之一WTAP通过m6A-HuR依赖的ETS1表观遗传沉默促进肝细胞癌的进展[45];KIAA1429甲基化识别酶YTHDF2通过调节OCT4mRNA的m6A甲基化促进肝癌CSC表型和肿瘤转移[46];这些研究证明肝癌中异常表达的m6A修饰酶通过m6A甲基化修饰下游相关基因进行表观遗传调控，参与肝癌的发生发展过程。

其他的RNA甲基化修饰还包括m1A，目前在肝癌中研究较少。有研究发现，受m1A甲基化修饰的基因在HCC的进展中起重要作用，并可用于诊断和预后[47]。m5C修饰的H19-lncRNA可能通过募集G3BP1癌蛋白促进肿瘤的发生和发展[48]。

6

目前的表观遗传学研究方法和思路如下。(1)DNA甲基化研究，可以针对肝癌的不同病理特征，获取对应的组织，采用全基因组甲基化测序(wholegenomebisulfitesequencing,WGBS)分析不同病理特征下肝癌的DNA甲基化状态，或者简化基因组甲基化测序(reducedrepresentationbisulfitesequencing,RRBS)分析不同病理特征下肝癌70%的基因启动子区的DNA甲基化状态。(2)针对染色质重塑的研究，主要通过蛋白质组学和修饰组学(磷酸化或者乙酰化等)的方式聚焦不同病理特征下肝癌的染色质修饰复合体分子表达的变化和修饰的变化，后续借助相关的染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,ChIP)实验等进行机制研究。(3)针对miRNAs研究，通过miRNA芯片或小RNA测序技术分析不同病理特征下肝癌差异表达的miRNAs，并构建相应的细胞和动物模型进行后续机制探讨;针对lncRNAs研究，主要通过高通量RNA-seq测序分析获取肝癌相关的lncRNAs，后续机制研究借助RIP、RNA-pulldown、RNA纯化的染色质分离技术(chromatinisolationbyRNApurification,ChIRP)等技术进行实施;针对circRNAs研究，可通过高通量测序筛选与肝癌相关的circRNAs，并研究其ceRNA调控机制或者蛋白质结合机制。(4)针对m6A甲基化测序，利用RNA甲基化测序(methylatedRNAimmunoprecipitationsequencing,MeRIP-seq)研究疾病发展过程中RNA甲基化图谱的改变。

7

肝癌的发生机制十分复杂，也就意味着需要从多个层面研究和解释肝癌的发生机制，从而为肝癌的治疗提供有价值的理论指导。本文阐述了肝癌发生过程中存在的各种表观遗传修饰：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNAs、m6A甲基化等。表观遗传修饰异常存在于肝癌的发生、发展过程中，对其进行精准的研究，可为肝癌的靶向治疗和个性化治疗提供新的思路。

参考文献

[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics2020:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries.CACancerJClin,2021,71(3):209-249

[2]McGlynnKA,PetrickJL,LondonWT.Globalepidemiologyofhepatocellularcarcinoma:anemphasisondemographicandregionalvariability.ClinLiverDis,2015,19(2):223-238

[3]ZhengY,HuangQ,DingZ,etal.Genome-wideDNAmethylationanalysisidentifiescandidateepigeneticmarkersanddriversofhepatocellularcarcinoma.BriefBioinform,2018,19(1):101-108

[4]KuramotoJ,AraiE,TianY,etal.Genome-wideDNAmethylationanalysisduringnon-alcoholicsteatohepatitis-relatedmultistagehepatocarcinogenesis:comparisonwithhepatitisvirus-relatedcarcinogenesis.Carcinogenesis,2017,38(3):261-270

[5]GalleE,ThienpontB,CappuynsS,etal.DNAmethylation-drivenEMTisacommonmechanismofresistancetovarioustherapeuticagentsincancer.ClinEpigenetics,2020,12(1):27

[6]HanTS,BanHS,HurK,etal.Theepigeneticregulationofhccmetastasis.IntJMolSci,2018,19(12):3978

[7]WahidB,AliA,RafiqueS,etal.Newinsightsintotheepigeneticsofhepatocellularcarcinoma.BiomedResInt,2017,2017:1609575

[8]LiuQ,ChenK,LiuZ,etal.BORISup-regulatesOCT4viahistonemethylationtopromotecancerstemcell-likepropertiesinhumanlivercancercells.CancerLett,2017,403:165-174

[9]FeiQ,ShangK,ZhangJ,etal.HistonemethyltransferaseSETDB1regulateslivercancercellgrowththroughmethylationofp53.NatCommun,2015,6:8651

[10]WeiL,ChiuDK,TsangFH,etal.HistonemethyltransferaseG9apromoteslivercancerdevelopmentbyepigeneticsilencingoftumorsuppressorgeneRARRES3.JHepatol,2017,67(4):758-769

[11]HamamotoH,MaemuraK,MatsuoK,etal.Delta-like3issilencedbyHBxviahistoneacetylationinHBV-associatedHCCs.SciRep,2018,8(1):4842

[12]TianH,GeC,ZhaoF,etal.DownregulationofAZGP1byIkarosandhistonedeacetylasepromotestumorprogressionthroughthePTEN/AktandCD44spathwaysinhepatocellularcarcinoma.Carcinogenesis,2017,38(2):207-217

[13]LiYH,ZhongM,ZangHL,etal.MTA1promoteshepatocellularcarcinomaprogressionbydownregulationofDNA-PK-mediatedH1.2T146phosphorylation.FrontOncol,2020,10:567

[14]AiharaA,TanakaS,YasenM,etal.TheselectiveAuroraBkinaseinhibitorAZD1152asanoveltreatmentforhepatocellularcarcinoma.JHepatol,2010,52(1):63-71

[15]NakaoK,TanakaS,MiuraT,etal.NovelAurora/vascularendothelialgrowthfactorreceptordualkinaseinhibitorastreatmentforhepatocellularcarcinoma.

CancerSci,2015,106(8):1016-1022

[16]WuH,YangTY,LiY,etal.Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6promoteshepatocarcinogenesisbyinteractingwithhistonedeacetylase3toenhancec-mycgeneexpressionandproteinstability.Hepatology,2020,71(1):148-163