林业技术分析论文提纲

论文题目：杉木生长素早期应答基因SAUR的克隆与功能分析

摘要：杉木（Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook）是我国南方重要的速生用材树种之一,因其具有材质优良和速生丰产等特点被广泛种植,在我国林业生产中占据重要地位。长期林业生产实践表明,铝毒是我国南方酸性土壤中制约杉木生长,导致杉木人工林产量下降的主要原因之一。因此如何改善酸性土壤上杉木的生长,提高杉木人工林产量已成为当前亟待解决的问题。与其他植物一样,杉木在酸性土壤中的生长发育是一个动态变化的过程,它通过不断整合自身发育与环境信号,实现对自身生长发育的调控。作为调控植物生长发育关键激素之一,生长素在介导植物响应环境和自身发育信号中扮演着关键角色。尽管生长素在调控植物铝胁迫耐性中的作用早已被证实。但是,这一过程涉及生长素信号转导途径的一系列基因和调控元件,而生长素早期应答基因SAUR作为生长素信号转导途径的上游基因,在介导生长素对植物生长发育和非生物胁迫调控过程中扮演着关键角色。然而,迄今为止介导生长素调控植物铝胁迫耐性的分子机制尚不完全清楚。因此,开展杉木ClSAUR基因家族及启动子克隆、不同生理条件下的表达模式分析和铝胁迫下基因功能研究,对于明确ClSAUR基因在杉木生长发育和铝胁迫中的作用和地位,加深对ClSAUR基因在杉木生长发育和铝胁迫中的调控作用机制的了解,并为进一步利用基因工程手段改良杉木抗性,从而最终提高铝胁迫下杉木人工林的产量提供理论依据。主要研究结果如下:1、杉木ClSAUR基因家族的克隆与生物信息学分析利用RT-PCR和RACE技术,从杉木组培苗中克隆得到8个ClSAUR基因家族成员的cDNA和gDNA序列。生物信息学分析结果表明,杉木ClS4 UR基因家族均不含内含子,所编码的氨基酸个数在95～196之间,且所有ClSAUR蛋白均为定位于细胞质的不具有跨膜结构的非分泌蛋白。同时,除ClSAUR25为酸性蛋白、ClSAUR36为稳定蛋白及ClSAUR29为疏水性蛋白外,其余杉木ClSAUR蛋白成员为碱性亲水的不稳定蛋白。功能结构域分析显示,ClSAUR蛋白家族均属于生长素诱导的超家族成员,含有PLN结构。杉木ClSAUR蛋白不同成员在磷酸化位点数和位置上差异较大,且大部分杉木ClSAUR蛋白成员的磷酸化修饰主要是以丝氨酸为主。蛋白结构分析表明,ClSAUR2、ClSAUR24、ClSAUR25、ClSAUR29、ClSAUR36和ClSAUR39均以无规卷曲为主,而ClSAUR50和ClSAUR91则以α螺旋为主。2、杉木ClSAUR25基因的启动子克隆及序列分析通过热不对称PCR反应从杉木基因组DNA中获得长为1471 bp的ClSAUR25基因5’调控序列,该5’调控序列具有3个核心启动子区,分别位于第226～276bp、第1034～1084bp和第1234～1284 bp上,且3个核心启动子区的可能转录起始位点均为C。进一步分析发现该5’调控序列共有5个CpG岛,分别位于第1148～1347 bp、1149～1348 bp、1150～1349 bp、1151～1350 bp和1152～1351 bp。顺式作用元件分析表明,该5’调控序列不仅含有丰富的核心元件CAAT-box和TATA-box,还存在光响应元件、乙烯响应元件、金属响应元件、厌氧响应元件、分生组织特异性元件、胚乳表达元件、生理周期响应元件及大量功能未知元件。此外,ClSAUR25基因可能还受bZIP类转录因子调控。3、不同生理条件下杉木ClSAUR基因家族的表达分析利用qPCR技术分析了杉木ClSAUR基因家族在愈伤组织不同形成时期、不同组织部位以及生长素不同处理时间的表达情况。结果表明ClSAUR基因家族不同成员在愈伤组织形成的不同阶段表达存在明显差异,ClSAUR2和ClSAUR24基因表达主要在杉木愈伤组织诱导初期和分化期受到显著诱导,ClSAUR25基因表达量在杉木愈伤组织诱导、分裂及分化整个生长过程中均显著上调,ClSAUR50、ClSAUR91和ClSAUR39则主要在杉木愈伤组织诱导初期受诱导表达,暗示ClSAUR基因家族不同成员在杉木愈伤组织发育过程的不同阶段扮演着不同的角色。ClSAUR基因家族不同成员组织特异性表达结果表明,不同基因成员或同一基因在不同组织中的表达存在显著差异,其中ClSAUR2和ClSAUR39基因在叶片的相对表达量最大,ClSAUR25、ClSAUR50和ClSAUR91基因在根中相对表达量最大,ClSAUR24基因则在茎中相对表达量最大,暗示不同家族成员在不同组织部位所起的功能有所不同。此外,不同ClSAUR成员对生长素的响应情况也存在差异,其中ClSAUR24、ClSAUR25、ClSAUR39和ClSAUR91基因对生长素响应较为迅速（0.5 h就能被显著诱导表达）,随后这些基因表达量均呈现先上升后下降的趋势,说明这些基因在早期生长素信号转导过程中起着重要作用。而ClSAUR2在早期（0.5 h）则被生长素迅速抑制表达,随后其表达量呈先下降后上升再下降的趋势,暗示其可能在生长素信号转导后期发挥着特定的功能。与上述生长素响应基因表达模式不同的是,ClSAUR50基因的表达相对复杂,其相对表达量整体变化呈先上升后下降再上升的趋势。4、杉木ClSAUR25基因的功能分析将ClSAUR25基因ORF构建到pCambia1301-1表达载体中,采用农杆菌侵染法将p1301-ClSAUR25导入拟南芥和烟草中,获得拟南芥转基因植株和转基因烟草组培苗。通过对转基因烟草内源激素含量分析,发现转基因烟草的lAA和ABA含量均高于野生型,而GA和ZR含量均低于野生型烟草。通过外源生长素对烟草进行处理,结果表明随着处理时间的延长,野生型和转基因烟草ClSAUR25的相对表达量呈先上升后下降的趋势,在1 h时两者的相对表达量显著提高并达到峰值。整体而言,野生型烟草的ClSAUR25相对表达量均显著低于转基因烟草的相对表达量。耐铝结果分析表明,铝胁迫显著增加烟草体内过氧化氢含量,而且转基因烟草中过氧化氢增幅小于野生型,与该结果一致的是,铝胁迫均显著诱导MDA的积累,但转基因烟草中MDA增幅小于野生型,表明转基因烟草受到的氧化损伤较野生型小,转基因烟草具有较强的耐铝性。铝胁迫下烟草体内可溶性糖和脯氨酸含量分析表明,铝胁迫显著增加野生型烟草中可溶性糖和脯氨酸以及转基因烟草体内脯氨酸的含量,但铝胁迫显著降低转基因烟草中可溶性糖含量,上述结果表明转基因烟草植株耐铝性的增强与其体内渗透物质含量的改变关系不大。另一方面,铝胁迫显著增加野生型烟草中的SOD活性,而转基因烟草中SOD活性变化不明显,但转基因烟草自身具有较高的本底SOD活性。铝胁迫显著增加野生型和转基因烟草中POD和CAT活性,而且铝胁迫下野生型烟草中POD酶活性增幅显著大于转基因烟草,铝胁迫下转基因烟草中CAT活性增幅显著高于野生型,表明转基因烟草可能通过提高CAT活性来增强其活性氧清除能力,减轻铝诱导的氧化损伤。此外,野生型和转基因烟草柠檬酸分泌基因NtMATE和铝的液泡转运基因NtALS3定量分析结果表明,铝胁迫能显著增加野生型和转基因烟草中NtMATE基因的表达量,铝胁迫下野生型和转基因烟草中NtMATE基因的表达量分别是各自对照的2.75和2.96倍,而且在正常和铝胁迫条件下转基因烟草NtMATE的表达量均显著高于野生型。另一方面,铝胁迫对野生型烟草NtALS3基因表达的影响并不显著,但铝胁迫却显著诱导该基因在转基因烟草中的表达,铝胁迫下其表达量是野生型的3.21倍,暗示铝胁迫下转基因烟草可通过增加NtMATE和NtALS3表达量,促进有机酸的分泌和铝向液泡中的转运,减少转基因烟草对铝的吸收,减轻铝的毒害,从而最终增强其对铝胁迫的耐性。

关键词：杉木;ClSAUR基因;基因克隆;启动子;功能分析

学科专业：森林培育

摘要

ABSTRACT

1 引言

1.1 生长素在植物生长发育过程中的作用

1.2 植物生长素调控机制

1.2.1 生长素的合成

1.2.2 生长素的极性运输

1.2.3 生长素的信号途径

1.3 植物生长素响应基因

1.3.1 ARFs响应因子

1.3.2 Aux/IAAs基因家族

1.3.3 CH3基因家族

1.3.4 SAURs基因家族

1.4 技术路线

1.5 研究内容和目的意义

1.5.1 本研究的内容

1.5.2 本研究的目的意义

2 杉木生长素早期应答基因ClSAURs基因家族克隆

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 试剂材料

2.1.3 仪器设备

2.2 方法

2.2.1 杉木总RNA和DNA的提取

2.2.2 cDNA第一链的合成

2.2.3 引物设计及PCR扩增反应

2.2.4 目的片段的回收、克隆和测序

2.3 结果与分析

2.3.1 杉木总RNA和基因组DNA的提取结果

2.3.2 杉木ClSAURs基因保守片段克隆

2.3.3 杉木ClSAURs基因3'/5'RACE

2.3.4 杉木ClSAURs基因的ORF序列扩增

2.3.5 杉木ClSAURs基因的gDNA序列扩增

2.4 小结

3 杉木ClSAURs基因家族的生物信息学分析

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果分析

3.3.1 杉木ClSAUR蛋白的理化性质分析

3.3.2 杉木ClSAUR蛋白序列亲水性和疏水性及信号肽预测

3.3.3 杉木ClSAUR蛋白亚细胞定位及跨膜结构预测

3.3.4 杉木ClSAUR蛋白的磷酸化位点分析

3.3.5 杉木ClSAUR蛋白的二三级结构预测

3.3.6 杉木ClSAUR基因内含子和外显子预测

3.3.7 杉木ClSAUR蛋白的功能结构域和系统进化树分析

3.4 小结

4 杉木ClSAUR25基因启动子克隆及序列分析

4.1 材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 试剂材料

4.1.3 仪器设备

4.2 方法

4.2.1 杉木基因组DNA的提取

4.2.2 引物设计及PCR扩增反应

4.2.3 目的片段回收、克隆和测序

4.2.4 启动子序列分析

4.3 结果与分析

4.3.1 杉木ClSAUR25基因的启动子克隆

4.3.2 杉木ClSAUR25基因的启动子序列分析

4.4 小结

5 不同生理条件下杉木ClSAUR基因家族的表达分析

5.1 材料

5.1.1 植物材料

5.1.2 试剂材料

5.1.3 仪器设备

5.2 方法

5.2.1 杉木愈伤组织的诱导

5.2.2 杉木组培苗生根培养

5.2.3 生长素处理

5.2.4 实时荧光定量PCR分析

5.3 结果与分析

5.3.1 杉木愈伤组织形成过程中ClSAUR基因家族的定量表达分析

5.3.2 杉木不同组织部位ClSAUR基因家族的定量表达分析

5.3.3 生长素处理下杉木ClSAUR基因家族的定量表达分析

5.4 小结

6 杉木ClSAUR25基因的功能分析

6.1 材料

6.1.1 植物、菌株和载体材料

6.1.2 试剂材料

6.1.3 仪器设备

6.2 方法

6.2.1 杉木ClSAUR25过表达载体的构建

6.2.2 过表达载体的农杆菌转化

6.2.3 遗传转化

6.3 结果与分析

6.3.1 p1301-ClSAUR25过表达载体的获得

6.3.2 p1301-ClSAUR25转化农杆菌

6.3.3 转基因拟南芥的获得

6.3.4 转基因烟草的获得

6.3.5 过表达ClSAUR25基因对烟草内源激素含量的影响

6.3.6 过表达ClSAUR25基因烟草在生长素处理下的表达分析

6.3.7 过表达ClSAUR25基因烟草的耐铝性分析

6.4 小结

7 讨论与研究展望

7.1 讨论

7.1.1 杉木ClSAUR家族蛋白的磷酸化修饰

7.1.2 杉木ClSAUR25基因启动子的潜在功能

7.1.3 杉木不同生理条件下ClSAUR基因家族的表达分析

7.1.4 杉木ClSAUR25基因的功能分析

7.2 研究展望

参考文献

致谢