药物研发有机化学论文提纲

论文题目：DNA编码酚酸衍生物库的合成及血管紧张素Ⅱ 1型受体靶向活性成分筛选与评价

摘要：心血管疾病是危害人类健康的常见疾病,具有发病率高和药物依赖性大的特点,其高效防治药物研发是医药领域的热点问题。本论文立足活血化瘀中药在心血管疾病防治方面的临床应用,聚焦酚酸衍生物的发现和评价,将DNA编码技术引入酚酸衍生物的结构修饰,合成了含有32000个酚酸衍生物的DNA编码化合物库。采用固定化血管紧张素Ⅱ 1型受体（AT1R）色谱对该化合物库进行筛选,发现了7个富集指数高于20的活性成分。经体外和体内药效学评价,获得了具有显著降压活性的化合物hit 1。该研究能为中药酚酸衍生物的合成提供新方法,有望形成中药活性成分结构修饰和筛选新策略,对高效创新药物研发具有积极作用。全文包含五个章节,作者的主要工作如下:1、建立了DNA编码酚酸衍生物库合成新方法。采用split＆pool方法,通过酰化反应,用20种不同序列的DNA标签修饰20种不同的Fmoc-氨基酸,将20份产物混合后脱去Fmoc保护基,高效液相色谱纯化后等分为20份,与另外20种不同序列DNA编码的氨基酸反应,重复三次,获得含8000个小分子的DNA编码化合物库。进一步分别与咖啡酸、没食子酸、原儿茶酸和阿魏酸进行酰化反应,合成了含有32000个酚酸衍生物的DNA编码化合物库,为开展酚酸衍生物活性成分研究提供了足量的筛选对象。2、建立了DNA编码酚酸衍生物库AT1R靶向活性成分高效筛选方法。将卤代烷烃脱卤素酶（Halo）融合至AT1R非活性碳末端,大肠杆菌表达获得融合受体,利用细胞裂解液中重组受体结构中脱卤素酶与6-氯己酸修饰微球间的特异性生物正交反应,将受体共价固定至微球表面,制备固定化AT1R色谱固定相。通过AT1R特异性沙坦类药物对其特异性和稳定性进行表征,用该色谱模型对DNA编码酚酸衍生物库进行分析,收集色谱保留成分,经PCR扩增和高通量测序进行结构鉴定。结果表明,固定化AT1R具有特异性强,稳定性好和活性高等特点,能实现复杂样品中受体靶向活性成分高效筛选。所合成的酚酸衍生物库中含有7个富集指数大于20的活性成分,其中,化合物hit 1和化合物hit 2富集程度最高。采用经典有机化学反应对其进行全合成,获得足量高纯度产物。该研究为DNA编码酚酸衍生物库中AT1R靶向活性成分的筛选提供了新方法,能为其他DNA编码化合物库受体靶向活性成分高效筛选提供借鉴。3、明确了活性化合物hit 1和hit 2与固定化AT1R的相互作用。以AT1R特异性药物阿齐沙坦、坎地沙坦、缬沙坦和奥美沙坦为工具,采用直接进样法和峰轮廓法表征固定化AT1R表面药物作用特征,明确hit 1和hit 2与AT1R的相互作用。结果表明,四种工具药与固定化AT1R存在两类结合位点,低浓度时结合常数分别为1.56×10~7,4.39×10~6,8.48×10~6和6.90×10~6M-1,静电相互作用为药物与AT1R相互作用的主要推动力;解离速率常数分别为0.0114,0.0514,0.0754和0.0131 min-1。hit 1和hit 2与AT1R的结合常数分别为5.43×10~6和3.25×10~6M-1,解离速率常数为0.0579和0.1866 min-1。与hit2相比,hit 1结合常数与解离速率常数更接近工具药,提示其具有更高药理活性,作用机制与工具药相似。4、明确化合物hit 1具有显著的降压活性。采用放射性免疫配体法探讨hit 1的体外药效特征;选择离子对质谱法研究5.0,15.0和30.0 mg/kg给药剂量hit 1大鼠体内药代动力学;制作双肾双夹肾性高血压大鼠模型,评价hit 1体内降压活性。结果表明:hit 1可使[125I]-Sar1-Ang II竞争曲线右移约10倍,其半数抑制浓度(IC50)为19.6 n M;hit1三个给药剂量的最大达峰浓度分别为80.6±15.4,220.4±23.7,445.8±29.5μg/L,曲线下面积AUC0-t为5707.6±174.5,18123.5±926.2,34243.0±1488.2μg/L×min,AUC0-inf为6088.6±237.2,19332.5±1034.1,35096.1±1534.0μg/L×min,达峰时间,表观消除速率常数和半衰期无显著变化,在拟定给药剂量范围hit 1体内药代动力学符合线性特征;给药量为15 mg/kg时,hit 1能显著降低大鼠血压,且不影响其心率,为临床研发抗高血压创新药物提供了潜在的可能。

关键词：中药活性成分;酚酸衍生物;DNA编码化合物库;血管紧张素Ⅱ1型受体

学科专业：中药药物化学

摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 中药防治心血管疾病的应用和研究

1.2.1 活血药的应用和研究

1.2.2 补气药的应用和研究

1.2.3 清热药的应用和研究

1.3 中药活性成分防治心血管疾病的研究进展

1.3.1 酚酸类活性成分

1.3.2 醌类活性成分

1.3.3 皂苷类活性成分

1.3.4 其他活性成分

1.4 DNA编码化合物库及其筛选方法概述

1.4.1 DNA编码化合物库概述

1.4.2 DNA编码化合物库筛选方法研究进展

1.5 研究对象简介

1.6 本论文的研究内容及意义

第二章 DNA编码酚酸衍生物库的合成

2.1 引言

2.2 仪器及试剂

2.2.1 仪器

2.2.2 试剂

2.3 DNA编码酚酸衍生物库的合成

2.3.1 DNA链的设计及试剂的准备

2.3.2 DNA起始链的反应表征

2.3.3 DNA编码酚酸衍生物库的合成

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 DNA编码酚酸衍生物库AT1R靶向成分筛选

3.1 引言

3.2 仪器与试剂

3.2.1 仪器

3.2.2 试剂

3.3 AT_1R色谱固定相的制备及DNA编码酚酸衍生物库靶向成分筛选

3.3.1 重组质粒的构建及表达

3.3.2 AT_1R色谱固定相的制备

3.3.3 AT_1R色谱固定相的表征

3.3.4 DNA编码酚酸衍生物库AT_1R靶向活性成分筛选

3.3.5 DNA编码酚酸衍生物库AT_1R靶向成分鉴定

3.3.6 AT_1R靶向化合物hit1和hit2 的合成

3.4 结果与讨论

3.4.1 Halo- AT_1R目的蛋白的表达

3.4.2 AT_1R色谱固定相的形貌表征和元素分析

3.4.3 AT_1R色谱固定相的特异性和稳定性考察

3.4.4 DNA编码酚酸衍生物库AT_1R靶向活性成分筛选

3.4.5 DNA编码酚酸衍生物库AT_1R靶向活性成分鉴定

3.4.6 AT_1R靶向化合物hit1和hit2 的合成

3.5 本章小结

第四章 靶向化合物与固定化AT1R的相互作用研究

4.1 引言

4.2 仪器与试剂

4.2.1 仪器

4.2.2 试剂

4.3 理论

4.3.1 直接进样法

4.3.2 热力学研究

4.3.3 峰轮廓法

4.4 四种配体及靶向化合物与固定化AT_1R的相互作用研究

4.4.1 直接进样法研究四种配体与固定化AT_1R的热力学特征

4.4.2 峰轮廓法研究四种配体与固定化AT_1R的动力学特征

4.4.3 靶向化合物与固定化AT_1R的相互作用研究

4.5 结果与讨论

4.5.1 四种配体与固定化AT_1R的热力学研究

4.5.2 四种配体与固定化AT_1R的动力学研究

4.5.3 靶向化合物和固定化AT_1R的相互作用研究

4.6 本章小结

第五章 AT1R靶向化合物的活性评价

5.1 引言

5.2 仪器及试剂

5.2.1 仪器

5.2.2 试剂

5.3 实验动物

5.4 AT_1R靶向活性化合物hit1 的体外评价

5.5 AT_1R靶向活性化合物hit1 的体外评价

5.5.1 药代动力学评价

5.5.1.1 LC-MS/MS条件

5.5.1.2 溶液的制备

5.5.1.3 方法学考察

5.5.1.4 靶向化合物hit1 的药代动力学研究

5.5.2 体内药效学评价

5.5.2.1 双肾双夹高血压大鼠模型的制备

5.5.2.2 大鼠体重、血压测量

5.5.2.3 大鼠心重指数检测

5.5.2.4 组织形态学观察

5.6 结果与讨论

5.6.1 靶向化合物hit1 的体外评价

5.6.2 靶向化合物hit1 的体内评价

5.6.2.1 体内药代动力学方法学研究

5.6.2.2 靶向化合物hit1 药代动力学研究

5.6.2.3 双肾双夹高血压大鼠模型制备

5.6.2.4 靶向化合物hit1 的体内药效学研究

5.6.2.5 大鼠心重指数的改变

5.6.2.6 大鼠心肌结构的改变

5.6.2.7 大鼠股动脉血管的改变

5.7 小结

总结与展望

参考文献

附图

致谢