呋喃西林代谢物单克隆抗体及荧光免疫层析试纸条的制备
摘 要：为建立一种基于荧光免疫层析技术的呋喃西林代谢物的快速检测方法，采用活性酯法合成呋喃西林代谢物（氨基脲盐酸盐）（semicarbazide hydrochloride，SEM）人工抗原，并获得SEM的单克隆抗体，通过将量子点微球（quantumdot submicrobeads，QBs）与SEM偶联，得到QBs探针，制备荧光免疫层析试纸条。结果表明：SEM免疫荧光层析试纸条检测鱼肉组织的检测限为0.247 μg/L，不同添加质量浓度的回收率均在70%～120%之间，批内、批间变异系数均在15%以下，符合我国动物源食品中兽药残留检测方法相关指导文件的规定，且在2～8 ℃条件下可以保存6 个月以上，稳定性良好。
关键詞：呋喃西林代谢物;荧光免疫层析;免疫抗原;样品预处理;量子点微球
引文格式：
郭会灿， 崔海波， 徐冬梅. 呋喃西林代谢物单克隆抗体及荧光免疫层析试纸条的制备[J]. 肉类研究， 2019， 33（3）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20181211-229. http：//www.rlyj.net.cn
GUO Huican， CUI Haibo， XU Dongmei. Preparation of monoclonal antibody and fluorescence immunochromatographic test strip for detecting furacilin metabolites[J]. Meat Research， 2019， 33（3）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20181211-229. http：//www.rlyj.net.cn
呋喃西林（Nitrofural），又称呋喃新、硝基呋喃腙、呋喃星，是一种硝基呋喃类药物，是一种可以治疗牲畜疾病的合成抗菌药。动物源性食品中硝基呋喃类药物及其代谢物的残留可通过食物链传递给人类并在机体内富集，长期富集会导致毒性和致癌风险，这种危害已引起了世界各国的极大关注。美国、澳大利亚、日本、欧盟、加拿大及新加坡等国家明确规定禁止在食品工业中使用此类药物[1-2]。各国严格执行对水产中该类药物的残留检测。残留监控措施主要从监控计划、抽样、检测、结果发布和处理五方面进行把控[3]。我国农业部已将呋喃西林列入首批禁用药第235号公告[4]，相关部门在全国范围围绕畜、禽、水产品的抗生素、禁用化合物及兽药残留超标等问题开展专项整治活动，严厉打击包括硝基呋喃类在内的药物非法使用、生产和销售。
呋喃类药物及其代谢物在机体内稳定性很差，在弱酸条件下（如人类胃液的酸性条件）从蛋白质中释放出来，在机体内其代谢物与组织蛋白结合后，可以形成稳定状态的化合物[5]，其中呋喃西林在组织中结合的代谢产物滞留时间最长，相对毒性反应也最强，现在各国明令禁止其在畜牧生产活动中添加或使用，在这种大环境下对呋喃类药物及其代谢物的研究及检测对从源头遏制此类药物的滥用显得尤为重要。
目前，对呋喃西林代谢物的检测方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、分光光度法、免疫分析法（immunoassay，IA）等。于慧娟等[6]利用HPLC法测定水产品中呋喃唑酮的残留量，方法灵敏度高，检测限为1.0 μg/kg。
彭涛等[7]利用气相色谱-质谱联用（liquid chromatography with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法同时测定动物肌肉组织中4 种呋喃类药物呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林的代谢物，呋喃它酮代谢物（5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxalidinone，AMOZ）和呋喃唑酮代谢物（3-amino-2-oxalidinone，AOZ）的定量限均为0.1 ng/g，呋喃西林代谢物（氨基脲盐酸盐）（semicarbazide hydrochloride，SEM）和呋喃妥因代谢物（1-amino-hydantoin，AHD）均为0.5 ng/g;AMOZ和AOZ的检测限均为0.05 ng/g，SEM和AHD均为0.1 ng/g。Cooper等[8]建立了虾组织中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的酶联免疫分析方法，检测限为0.1 μg/kg。
色谱技术样品处理过程繁琐、耗时、成本高，而且需要经过专门训练的人员来操作复杂的设备，并且其复杂的前处理不适合筛选大批量样品[9]。作为一种快速、灵敏、特异的检测方法，荧光免疫层析方法是热门且公认的快速检测方法[10]。本研究先通过衍生化进行抗原合成，再通过细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，对能够稳定、特异性分泌抗呋喃西林代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行建株，使用单克隆抗体建立用于检测呋喃西林代谢物残留的荧光免疫方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 动物BALB/c小鼠购自河北医科大学。
1.1.2 药品
盐酸氨基脲（semicarbazide hydrochloride，SEM·HCl）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC）、二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA） 美国Sigma公司;N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 索莱宝生物科技有限公司;邻醛基苯甲酸（2-carboxybenzaldehyde，2-CBA）、对醛基苯甲酸（4-carboxybenzaldehyde，4-CBA） 阿拉丁试剂（上海）有限公司;无水甲醇 无锡亚泰联合化工有限公司。
1.2 仪器与设备722紫外-可见分光光度计 上海光学仪器厂;JIDI-16R台式多用途高速冷冻离心机 广州吉迪仪器有限公司;MiLLi-Q Ingegral Lo超纯水系统 德国密理博公司;BS 124S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;T-Meter I荧光免疫分析仪 河北特温特生物科技发展有限公司。1.3 方法
1.3.1 免疫抗原的制备
半抗原的合成[11]：将0.4 g 4-CBA加入到2 mL纯水中，并将DMF缓缓加入上述溶液中，边滴加边搅拌直至4-CBA完全溶解，然后缓慢加入0.5 g SEM·HCl，并在室温下反应4 h;过滤反应溶液，得到淡黄色固体，用纯水洗涤3 次，在50 ℃条件下进行干燥，得到半抗原呋喃西林衍生物CPSEM（CP（羧基苯甲醛）与SEM的衍生物）。抗原的合成：称取21 mg CPSEM溶于2 mL DMF中，缓慢加入溶有18 mg NHS的PBS缓冲液，搅拌反应5 min后，加入3 mL溶有40 mg EDC的0.01 mol/L PBS缓冲液，在室温下搅拌2 h;称取60 mg BSA溶于2 mL PBS中，然后将上述反应溶液缓慢加入，4 ℃搅拌过夜;0.01 mol/L PBS透析3 d，-20 ℃保存备用。SEM抗原合成路线图如图1所示。检测原同法制备。
1.3.2 免疫抗原的鉴定
1.3.2.1 紫外扫描法
用PBS对CPSEM和BSA进行适当稀释，测定BSA的蛋白浓度，把CPSEM-BSA稀释到与BSA相同浓度，在220～700 nm波长下扫描，参考杨立国等[12]的方法计算BSA与CPSEM的分子偶联比。
1.3.2.2 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）鉴定选择分离凝胶为12%，浓缩凝胶为5%，通过SDS-PAGE对合成物进行鉴定。
1.3.2.3 免疫法
根据李春生等[13]的方法，通过CPSEM-BSA免疫BALB/c小鼠，并进行融合实验。
1.3.3 荧光微球（quantum dot submicrobeads，QBs）标记SEM单克隆抗体
采用EDC法偶联QBs和SEM抗体[14]：将QBs用0.1 mol/L、pH 5.5的MES溶液清洗2 遍，再用0.1 mol/L、pH 5.5的MES溶液5 mL复溶，10 000 r/min离心30 min，沉淀用MES溶液重悬，加入一定量的0.01 mol/L EDC，混合反应12 h;10 000 r/min离心30 min，沉淀用0.1 mol/L的Tris-1% Casein溶液复溶，混合反应4 h;10 000 r/min离心30 min，用0.1 mol/L的Tris-1%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）溶液复溶，制备得到将SEM抗体用QBs标记的产物，即QBs探针，4 ℃保存，备用。
1.3.4 硝化纤维素（nitrocellulose，NC）膜封闭条件的优化通过改变NC膜封闭液的各组分浓度，来降低背景干扰和假阳性率。采用筛选的封闭液浸泡NC膜，37 ℃烘干4 h，之后用划膜仪将T线和C线包被在NC膜上，37 ℃干燥3 h。干燥环境密封保存备用。
1.3.5 荧光免疫层析试纸条的组成QBs荧光免疫层析试纸条的组成如图2所示，其中QBs探针包被在结合垫上，SEM抗原作为T线、羊抗兔二抗作为C线喷涂在NC膜上。
1.3.6 样品预处理
取2 g均质鱼肉样本于50 mL离心管中，依次加入4 mL去离子水、0.5 mL 1 mol/L HCl和100 μL 2-硝基苯甲醛，充分振荡，置于60 ℃恒温水浴孵育1 h;取出后依次加入5 mL 0.1 mol/L K2HPO4、0.4 mL 1 mol/L NaOH和5 mL乙酸乙酯，充分振荡2 min，室温条件下5 000 r/min离心10 min;取出2.5 mL乙酸乙酯层（上层）到5 mL离心管中，50 ℃氮气吹干，加入1 mL正己烷溶解，加入1 mL PBS充分混合30 s;室温条件下5 000 r/min离心10 min，取50 μL下层用于分析。
1.3.7 荧光免疫层析试纸条性能测试
1.3.7.1 检测限
根据欧盟《动物源性食品中兽药残留检测方法》的规定[15]，分别测定20 份鱼肉组织空白样品，按照1.3.6节的方法处理样品，用回归方程计算样品残留浓度，用SPSS软件得出样品浓度的平均值（）和标准差（s），以+3s作为鱼肉组织的最低检测限。
1.3.7.2 准确度
通过鱼肉样本添加回收实验检测荧光免疫层析试纸条的准确度[16-18]。在空白鱼肉组织中添加不同质量浓度的待测物，按照1.3.6节的方法处理样品，重复3 次，用荧光免疫层析试纸条进行测试，在荧光免疫分析仪上读取检测结果。按照公式（1）计算回收率。
1.3.7.3 精密度
精密度實验结果用变异系数来表示[19-21]。取3 个批次的试剂盒进行批间和批内测定，批间测定：向鱼肉组织中添加2 个不同质量浓度的待测物，每个质量浓度重复测定5 次，得出和s;批内测定：向鱼肉组织中添加2 个不同质量浓度的待测物，进行重复测定，得出和s，计算变异系数，分析批内和批间精密度。按照公式（2）计算变异系数。
1.3.7.4 稳定性
将荧光免疫层析试纸条分为3 组，分别在2～8 ℃、37 ℃、-20 ℃温度条件下进行稳定性测试[22-24]。2～8 ℃条件下保存6 个月、每个月检测1 次，37 ℃和-20 ℃条件下放置6 d、每天检测1 次，测定阴性样本的测定值和回收率等参数。
1.4 数据处理采用SPSS统计软件进行数据处理，Origin制图软件绘制标准曲线。
2 结果与分析
2.1 人工合成SEM抗原的鉴定
2.1.1 紫外扫描法鉴定
由图3可知，BSA的最大吸收峰在280 nm波长处，CPSEM的最大吸收峰在275 nm波长处，BSA和CPSEM偶联后，主峰位移至285 nm波长处，出现紫外叠加，表明偶联成功。根据朗伯-比尔定律，计算出CPSEM-BSA的分子结合比为11.8∶1。同理，计算出CPSEM-OVA的分子结合比为21∶1。
2.1.2 SDS-PAGE法鉴定
由图4可知，BSA条带约在68 kDa处，CPSEM-BSA与BSA的电泳速率稍有差异，CPSEM-BSA的条带滞后，说明其分子质量较BSA有所增加，推断是BSA连接了CPSEM所致，通过紫外凝胶成像系统分析软件计算的偶联比和紫外扫描结果一致。
2.1.3 效价测定
通过间接酶联免疫吸附法测定小鼠血清效价，针对抗体和抗原特异性结合情况判断免疫是否成功。
由表1可知，人工合成的SEM抗原免疫小鼠后，效价最高达1∶512 000，特异性良好。
2.2 NC膜封闭条件的优化结果
封闭液目的在于封闭多余的结合位点，阻断金标抗体在NC膜上的非特异性结合，保持背景的干净，突出检测线的颜色[25-26]。由表2可知，采用封闭液1封闭后，显色明显，且无背景颜色，说明封闭液1封闭效果很好。采用封闭液3封闭后，得到的检测线颜色虽然很深、很明显，但增加了一定的背景颜色，降低了检测线相对于背景的反差。封闭液4和5的背景颜色浅，但是检测线颜色浅，显色效果不明显。因此，选择封闭液1进行封闭。
2.3 SEM荧光免疫层析试纸条的性能测试结果
2.3.1 标准曲线的建立
标准曲线方程为y=-1.444 5x+1.485 5（R?=0.992 9），线性关系良好。测定20 份空白鱼肉组织样品的平均值为0.154 μg/L，标准差为0.031 μg/L，鱼肉组织的检测限为0.247 μg/L。
2.3.2 准确度及精密度测定结果
由表3可知，鱼肉组织添加回收实验的回收率均在70%～120%之间，批内、批间变异系数均在15%以下，符合我国动物源食品中兽药残留检测方法相关指导文件的规定。
2.3.3 稳定性测定结果
由表4可知，SEM荧光免疫层析试纸条的阴性样本测定值（T/C值）、R2、样本回收率没有超出正常范围，其中阴性样本测定值（T/C值）随着保存时间的延长有所下降，但仍在3.0以上。试纸条的各项指标均符合指导原则的要求。
3 讨 论
药物残留免疫荧光检测方法的建立包括待测物的甄选、完全抗原的合成、特异性抗体的制备、检测方法的建立及样本的预处理等内容[27]。完全抗原的合成很关键，如果结构中含有药物的特征结构，尤其是立体化学特征，则能够被免疫活性细胞识别并特异性结合[28]，SEM半抗原自身缺乏羧基末端，通过NHS-EDC法添加上含苯环结构的羧基末端[29]，且苯环结构作为含有活性末端的间隔臂，有助于特异性部位的暴露与识别。SEM是小分子物质，相对分子质量为75，不具备免疫原性，只有反应原性，目前还没有针对SEM的特异性抗体出现，目前的研究都只是针对SEM的衍生物CPSEM。故本研究通过衍生化引入苯环结构，使特异性部位暴露，增强SEM的免疫原性，使其与蛋白质偶联，刺激机体产生免疫应答，从而刺激机体产生特异性抗体。
基于免疫分析技术研究的报道目前较少，市售的产品也很紧缺，主要为来自德国Biopharm公司的产品。国内有一些针对SEM的研究报道，但针对酶联免疫吸附检测和胶体金的研究居多。唐勇等[30]通过制备抗CPSEM单抗-纳米金-单链硫醇化DNA复合物，建立了SEM免疫吸附生物条码检测方法，此检测方法灵敏度为8 pg/mL。何方洋等[31]建立了基于免疫胶体金技术的快速检测方法，用于测定饲料样本中的呋喃西林，此方法的检测限为2 μg/L。赵正苗等[32]建立胶体金免疫层析法检测动物组织中残留的呋喃西林代谢物，此方法的检测限为1.0 μg/L。荧光免疫层析法是目前快速发展的一种免疫学检测技术，常用的荧光物质包括荧光素和荧光乳胶微球，荧光层析试纸条借助荧光检测仪器可以实现结果的定量检测。
4 结 论
本研究通过将QBs与SEM抗体结合，制备得到QBs探针，用于鱼肉组织检测时的检测限为0.247 μg/L，不同添加量条件下的回收率均在70%～120%之间，批内、批间变异系数均在15%以下，符合我国动物源食品中兽药残留检测方法相关指导文件的规定，且在2～8 ℃条件下可以保存6 个月以上，稳定性良好。
参考文献：
[1] 李军， 张会彩， 刘聚祥， 等. 酶联免疫吸附检测动物饲料中呋喃唑酮[J]. 中国兽医杂志， 2009， 45（8）： 85-86. DOI：10.3969/j.issn.0529-6005.2009.08.034.
[2] 蔣宏伟. 酶联免疫技术在动物产品中硝基呋喃类药物残留检测的应用[J]. 陕西农业科学， 2006（5）： 53-55.
[3] 祝伟霞， 刘亚风， 梁伟， 等. 动物性食品中硝基呋喃类药物残留检测研究进展[J]. 动物医学进展， 2010， 31（2）： 99-102. DOI：10.3969/j.issn.1007-5038.2010.02.023.
[4] 中华人民共和国农业部第235号公告[EB/OL]. （2002-12-24） [2018-12-10].
[5] LAI W H， FUNG D Y， XU Y， et al. Screening procedures for clenbuterol residue determination in law swine livers using lateral-flow assay and enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Journal of Food Protection， 2008， 71（4）： 865-869.
[6] 于慧娟， 蔡友琼， 毕士川， 等. 高效液相色谱法测定水产品中呋喃唑酮的残留量[J]. 色谱， 2005， 23（1）： 114-117. DOI：10.3321/j.issn：1000-8713.2005.01.031.
[7] 彭涛， 邱月明， 李淑娟， 等. 高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉中硝基呋喃类抗生素代谢物[J]. 检验检疫科学， 2003， 13（6）： 23-28. DOI：10.3969/j.issn.1674-5354.2003.06.007.
[8] COOPER K M， CADDELL A. Production and characterization of polyclonal antibodies to a derivative of 3-amino-2-oxazolidinone， a metabolite of the nitrofuran furazolidone[J]. Analytica Chimica Acta， 2004， 520： 79-86. DOI：10.1016/j.aca.2004.05.074.
[9] 王丽娜， 刘凯， 杜柏林， 等. UPLC/MS/MS测定动物尿液中9 种β-受体激动剂残留量[J]. 现代畜牧兽医， 2013（8）： 42-46. DOI：10.3969/j.issn.1672-9692.2013.08.018.
[10] 葛怀礼， 王莲， 李金卿， 等. 盐酸克伦特罗荧光定量检测试剂盒质量评价[J]. 中国畜牧兽医， 2014， 41（10）： 285-289.
[11] 赵亦静， 傅小伟， 张明洲， 等. 呋喃西林免疫抗原的合成与鉴定[J]. 现代农业科技， 2008， 14： 197-199. DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2008.14.151.
[12] 杨立国， 胡少昶， 魏平华， 等. 酶免疫测定技术[M]. 南京： 南京大学出版社， 1998： 189-284.
[13] 李春生， 刘静静， 杜顺丰， 等. 呋喃唑酮代谢物单克隆抗体和胶体金免疫层析试纸条的研制[J]. 现代食品科技， 2017， 43（3）： 326-331. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.6.048.
[14] 丁桥棋， 李丽， 范文韬， 等. 基于新型量子点荧光微球的氯霉素免疫层析试纸条的制备和应用[J]. 分析化学研究报告， 2017， 45（11）： 1686-1693. DOI：10.11895/j.issn.0253-3820.170300.
[15] 解泉源， 赖卫华， 刘春梅， 等. 大肠杆菌O157：H7荧光微球免疫层析试纸条的研制[J]. 食品科学， 2013， 34（16）： 353-357. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201316072.
[16] 李军， 刘莲娜， 孟晓璐， 等. 硝基呋喃类药物胶体金免疫层析试纸条的研制[J]. 畜牧与兽医， 2014， 46（1）：74-77.
[17] 段宏， 陈雪岚， 江湖， 等. 量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测恶性恶性疟原虫[J]. 分析化学， 2015， 43（3）： 338-343. DOI：10.11895issn.0253-3820.140848.
[18] ZHANG Mingxia， LI Cun， WU Yinliang. Determination of phenylethanolamine A in animal hair， tissues and feeds by reversed phase liquid chromatography tandem mass spectrometry with QuEChERS[J]. Journal of Chromatogrephy B， 2012， 900： 94-99. DOI：10.1016/j.jchromb.2012.05.030.
[19] 唐海波， 齐维， 唐诗幸， 等. 荧光定量快速检测鲜奶中四环素总量残留[J]. 现代食品科技， 2012， 28（11）： 1600-1602.
[20] 胡华军， 付涛， 张明洲， 等. CdTe/ZnSe壳核量子点免疫层析试纸条检测科伦特伦的研究[J]. 分析化学， 2010， 38（12）： 1727-1731. DOI：10.3724/SP.J.1096.2010.01727.
[21] 郭诗静， 唐海波， 齐维， 等. 免疫荧光层析快速检测猪尿中克伦特罗含量[J]. 现代食品科技， 2013， 29（5）： 1154-1156.
[22] 方琦， 黄锡荣， 李凯， 等. 降钙素原荧光免疫层析定量检测方法的建立及性能评估[J]. 中华检验医学杂志， 2012， 35（12）： 1102-1107. DOI：10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2012.12.011.
[23] 郭艳宏， 李飞， 邹明强， 等. 用于检测氯霉素类残留物的荧光免疫检测试纸条的研制[J]. 化学试剂， 2010， 32（6）： 496-498. DOI：10.3969/j.issn.0258-3283.2010.06.005.
[24] 范放， 朱海， 洪小柳， 等. 氯霉素荧光纳米颗粒免疫层析法的建立[J]. 现代农业科学， 2009， 16（9）： 13-14.
[25] KE Yan， FU Lanli， HONG Xiafei， et al. Acute clenbuterol induces hypotension， atrioventricular block and cardiacasystole in the rabbit[J]. Cardiovasc Toxicol， 2013， 13（1）： 85-90. DOI：10.1007/sl2012-012-9185-8.
[26] 胡佳丽， 于东升， 刘小雷， 等. 荧光免疫层析法快速测定牛奶中头孢氨苄残留量[J]. 中国食品卫生杂志， 2014， 26（4）： 362-366. DOI：10.13590/j.cjfh.2014.04.015.
[27] 姜艳彬， 孙冠如， 王海， 等. 盐酸克伦特罗胶体金快速检测试纸条的研制[J]. 中国畜牧兽医， 2010， 37（10）： 109-113.
[28] 朱海， 范放， 洪小柳， 等. 氯霉素荧光纳米颗粒免疫层析法的建立[J]. 现代农业科学， 2009， 16（9）： 13-14.
[29] 李丹妮， 黃华， 张倩， 等. 3 种β-受体激动剂荧光免疫层析试纸条的制备及特性研究[J]. 中国畜牧兽医， 2017， 44（8）： 2437-2442.DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.08.031.
[30] 唐勇， 王五洲， 向军俭， 等. 呋喃西林代谢物氨基脲免疫吸附生物条码检测方法的初步研究[J]. 食品科学， 2009， 30（18）： 274-277.
[31] 何方洋， 冯才伟， 孙震， 等. 饲料中硝基呋喃类药物免疫胶体金检测试纸条的研制[J]. 饲料工业， 2012， 33（23）： 35-38.
[32] 赵正苗， 罗晓琴， 汪善良， 等. 应用胶体金免疫层析法检测动物组织中呋喃西林代谢物的残留[J]. 上海畜牧兽医通讯， 2012（5）： 4-5.
作者：郭会灿 崔海波 徐冬梅
计
一、教材的地位和作用
《动物细胞融合与单克隆抗体》是人教版普通高中程标准实验教科书生物选修3专题二第2节动物细胞工程中第2小节的内容，由于细胞工程是建立在细胞结构、功能、生理等研究基础上的新技术，动物细胞融合又是细胞工程中基本技术之一，所以第2小节教学内容是在高中必修教材基础上的深入和扩展，也是第1小节动物细胞培养教学后的必然及延伸，是安排在学习了免疫、遗传与基因工程的基础上来进行教学的，学生既有一定的知识基础，又能为后面的微生物与发酵工程的教学奠定基础，尤其是为微生物的选种教学打下基础。同时，生物技术中各个分支领域相互渗透、相互促进，细胞融合技术也不例外，它在现代生物技术中具有一定的理论意义和经济意义。
二、学情分析
学生是在学习了《植物细胞工程》和《动物细胞培养和核移植技术》的基础上学习本节的，所以对于动物细胞融合这一部分应该能较轻松的理解，但是单克隆抗体的制备较复杂学生理解起来会有一定的难度，教师应详细介绍。
三、教学目标
根据新标要求和本节的具体内容，结合学生现有的知识水平，拟定下列教学目标。
、知识目标
(1)掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系。
(2)简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程。
(3)了解单克隆抗体在医学实践中的应用，并说其应用实例。
2、能力目标
(1)由植物体细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力、思维能力。
(2)让学生尝试设计单克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。
(3)分析动物细胞融合技术的意义和应用，逐步提高学生独立获取知识、分析问题和解决问题的能力。
3、情感目标
(1)初步培养学生勇于探索，不断创新的精神和合作精神。
(2)通过向学生介绍动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。
(3)关注动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展和应用前景。
四、教学重难点
、重点
(1)动物细胞融合技术。
(2)单克隆抗体的制备过程。
2、难点
单克隆抗体的制备过程。
五、教学实施程序
教师组织和引导
学生活动
设计意图
创设情境，导入新
、多媒体播放科幻电影中相关桥段，并展示人-鼠细胞杂交的图片，激发学生的学习欲望，导出本节的题。
2、进行学习目标的解读。
、观看电影片段和人-鼠细胞杂交的图片，回忆所学知识。
2、熟悉本节所学内容，把握难点内容。
1、回顾人-鼠细胞杂交试验，让学生对动物细胞融合技术有初步的认识。
2、教学做到有的放矢。
自主学习，知识梳理
、多媒体展示相关问题，组织学生进行解答。
2、根据学生的回答了解学生的预习情况。
、通过前预习并进行知识梳理，组内讨论，形成统一认知。
2、小组进行展示。
培养学生自主学习的能力，并体现学生的主体地位。
合作探究，班内交流
、多媒体展现合作探究内容，引导学生进行相互交流，并进行小组展示。
1、并合作交流，并确定学习难点内容。
培养学生合作精神。
点拨精讲，解难释疑
单克隆抗体制备的过程：
通过多媒体展示单克隆抗体的设计思路及制备过程，同时提出问题，学生讨论。
(教师讲解为主)
合作探究以下问题：
、如何获得B淋巴细胞?
2、如果把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会有几种融合方式(类型)?
3、选择杂交瘤细胞的两步筛选的目的各是什么?
4、如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养?
本部分知识较难，但学生通过预习能简单的分析出一部分，通过讨论使知识完整培养学生全面思考问题的能力
随堂练习，当堂反馈
多媒体展示相关习题
读题，思考与讨论，并进行解答
、巩固学生对实验分析解读能力。
2、通过对学生练习结果的评价，了解学生对知识的掌握情况，以便确定下一步的补偿性学习的安排。
归纳总结，科评价
、多媒体展示“三个重要过程”“三个一”，帮助学生记忆和理解。
2、对学生的堂表现进行评价。
观看多媒体展示内容，对所学内容有一个概括性的总结。
科学评价有利于小组内学生之间的相互团结，培养学生团队合作的意识
七、板书设计
222动物细胞融合与单克隆抗体
一、动物细胞的融合
二、单克隆抗体*
、概念：
、抗体11概念:Ig
2：B细胞
2、方法：
2、概念：杂交瘤细胞、高度单
一、抗体
3、过程
3、制备过程(杂交瘤制备技术)
4、意义：制备单克隆抗体
4、应用：“生物导弹”
八、教学反思
《动物细胞融合与单克隆抗体》教学设计思路
一、 教材
《动物细胞融合与单克隆抗体》是人教版高中生物选修3专题2第2节第2部分内容。单抗的制备是动物细胞工程中一个重点，也是一个难点，在高考中也经常出现。同时它也是一个学科内的综合内容，综合了免疫及动物细胞工程的相关知识。
二、 学情
本节课之前学生已经学习了植物体细胞杂交的有关内容，动物细胞融合与植物原生质体融合比较相似，有利于新内容的学习。本节内容是一个典型的学科内综合，综合了细胞培养、免疫、等知识点，但很多同学难以将这些内容联系起来，以及难以将制备过程中的筛选准确理解。
三、教学目标、重难点
根据课程标准、教材内容，学生的实际情况，我确定了以下的教学目标： 知识目标
⑴ 掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系。 ⑵ 简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程。 ⑶ 了解单克隆抗体在实践中的应用。 能力目标
让学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。 情感目标
介绍动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。
单克隆抗体是动物细胞工程的新技术，其制备过程尤其是两次筛选过程不太容易理解。因此，本节课的教学重点、难点就是单克隆抗体的制备过程。
四、教法、学法
动物细胞融合这一部分内容比较简单，学生已有植物原生质体融合过程作为基础，针对这一部分采用对比归纳法教学。而单克隆抗体这一部分内容较难，采用设问诱导法教学，引用两位科学家对单克隆抗体的研究过程，会起到较好的效果。
学生主要采用对比、自学、讨论相结合的方法，进行本节课的学习。
五、教学过程
为了能让学生动起来，能让课堂活起来，从而达到更好学习效果，我设计了如下教学环节： 【环节一】复习导入，联系已知：
引导学生复习回顾上节课所学植物体细胞杂交技术的基本知识，提出思考问题：动物细胞能像植物原生质体那样融合吗?出示必修1人----鼠细胞融合图片(PPT),此实验说明动物细胞也是可以融合的。那么，如何实现动物细胞的融合，以及动物细胞融合后有何用途呢?这就是今天这节课我们要学习的内容。这样就很自然地引入新课------《动物细胞融合与单克隆抗体》。这样设计回顾已知，提出新知，激发学生学习兴趣。
【环节二】对比归纳，知识迁移：
让学生阅读第52页动物细胞融合的有关内容，回答以下3个问题:⑴动物细胞融合的概念;⑵动物细胞融合的结果;⑶动物细胞融合的意义。
让学生回答以上问题，并引导学生推测出动物细胞融合与植物原生质体融合(已学)的原理和方法基本相同，特别指出动物细胞融合特有的诱导因素是灭活的病毒(生物技术资料卡P52)。然后出示植物细胞杂交和动物细胞融合比较表(PPT)，让学生将表补充完整。这样联系旧知识，提供一个比较的对象，以培养学生的知识迁移能力，并通过对融合过程示意图的描述(PPT)进一步加深对知识的理解和记忆。
技术的产生不是凭空产生的，了解发展史(P52)，体验科学技术是不断发展的过程。最后指出动物细胞融合技术有一个十分重要的用途，就是制备单克隆抗体，从而自然过渡到单克隆抗体的教学上。
【环节三】层层设问，步步深入：
通过设计问题串来诱导学生自学、讨论、总结，以激发学生的求知欲。针对重要内容设置问题，让学生带着问题读书，通过阅读课文，解决问题。可以使学生快速熟悉课文，提高教与学的效率，也能锻炼学生的自主学习能力。
让学生预习第52页最后一段话并回忆所学免疫内容，回答下面问题： ⑴产生细胞：__________________
⑵成分：__________。
1 ⑶特点：从__________中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
引导学生分析传统的抗体制备方法(ppt)，找出弊端，然后分析探索新的方法克服弊端，再引导学生分析新方法面临的问题，从而引出解决方案。
参考米尔斯坦和科勒极富创造性的设想，应该怎样设计?让学生明确单克隆抗体制备的设计思路。完成学案关于过程的图解和特点、优点。然后让学生带着以下问题体会单克隆抗体制备过程：
1、如何获得B淋巴细胞?
2、如果把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会有几种融合方式(类型)?
3、 选择杂交瘤细胞进行几次筛选?每次筛选的目是什么?
4、此过程运用哪些技术手段?
这样提出问题，诱导思考，步步深入地了解单克隆抗体的生产过程(动画)。最后让学生口述此过程，以加深对本节课重、难点的理解和记忆。
拓展资料“杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养介绍”了解先进的技术发展。
单克隆抗体应用的教学主要以学生自学为主，明确单克隆抗体的优点和应用及“生物导弹”的组成及特点(ppt)。 【环节四】课堂小结，构建框架(ppt)，明确本节课的学习内容：课后反思 【环节五】例题、随堂练习及作业(选题原则ppt)，及时反馈
根据这节课的教学重难点设置了课堂检测。它不仅是学生对所学知识的检测，也是教师掌握学情和检测教学效果的手段，更是课堂高效性的一种体现。
学习目标：
1、 举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。
学习重点:
1、单克隆抗体的制备和应用。
2、单克隆抗体的制备过程。
一、自主学习(阅读课本52页完成相关内容)
翻翻课本，动手填填，基础知识的梳理与强化，永远是学习的第一生命!
1、 动物细胞的融合
(1)概念：指 或 动物细胞结合形成一个细胞的过程，也称为细胞杂交。 (2)结果：形成 细胞。
(3)过程：不同 的两个细胞 细胞。
(4)意义：克服了 杂交的不亲和性，成为研究 、 、 肿瘤和生物 培育的重要手段。
2、 单克隆抗体
(1) 抗体：由淋巴细胞(浆细胞)产生，成分为球蛋白，具有 。从血清中分离出来的抗体产量低、纯度低、特异性差。 (2) 单克隆抗体的制备 a. 过程
b.杂交瘤细胞的特点：既能大量 ，又能产生 。 c.单克隆抗体的特点： 强、 高、产量大。 细品老师对知识的释疑、及时完成对应练习，对知识的深化理解、灵活运用，是学习的本质与灵魂。
二、小组讨论。(独立思考，合作共赢)
1、动物细胞的融合最有价值的应用是什么?细胞融合完成的标志是什么?
单克隆抗体
1、单克隆抗体?单：单个细胞? 。
提醒：①若a和b两种细胞融合，则融合的方式有三种 、 和
。满足要求的为 ，所以融合后要筛选。
克隆：无性繁殖抗体：抗原→B细胞→抗体特异性结合②动物细胞特有的诱导融合方式为灭火的病毒处理，其他的物理和化学方法在植物和动物细胞融合方面是通用的。
3、 单克隆抗体的确切定义是什么?
4、 制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞?在融合的过程中你可以找出几种类型的细胞?
5、 制备单克隆抗体的过程有两次筛选，两次筛选的目的是什么?
第一次筛选是
第二次筛选是 流畅的思维方法，规范的解题步骤，准确无误的答案，是获取高分的法宝。
三、同步训练
1、单克隆抗体是指 A.单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体 B.单个淋巴细胞增殖产生的抗体 C.单个杂交瘤细胞增殖产生的高度单一的抗体D.单个抗体通过克隆，产生大量抗体
2、细胞合成DNA有D和S两种途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞由这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。骨髓瘤细胞尽管没有S途径，但能不断的分裂增殖，将这两种细胞在试管的培养液中混合，加聚乙二醇促融，再加入氨基嘌呤可筛选出某种细胞。在培养液中存在的细胞种类及筛选出的细胞分别是(细胞融合是仅考虑两个细胞的融合) A.三种 杂交瘤细胞 B.五种 骨髓瘤细胞 C.五种 杂交瘤细胞 D.一种 杂交瘤细胞
3.(多选)将小鼠骨髓瘤细胞与一种B淋巴细胞融合，可使融合的细胞经培养产生单克隆抗体，其依据是
A.B淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖B.淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗体
C.骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体D.骨髓瘤细胞可以产生抗体，但不能无限增殖
4.下列用动物工程技术获取单克隆抗体的实验步骤中，不正确的是
A.将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞
B.用蛋白酶处理B淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞
C.用灭活的仙台病毒做诱导剂，促使B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合
D.筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体
5、结合单克隆抗体制备的流程回答下列问题。
① 技术是单克隆抗体技术的基础。 ②单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是
③动物细胞的融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用
④选出的杂交瘤细胞即具备骨髓瘤细胞 的特点，又具备淋巴细胞的 的特点。
⑤淋巴细胞是由骨髓中的 细胞分化发育而来。 ⑥杂交瘤细胞从培养基吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是
摘 要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。
关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞
现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。
1.国外现代生物技术产业发展的现状
自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术(包括近代生物技术)已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用;现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。
2.我国现代生物技术医药产业发展的现状
现代生物技术医药产业化进程：我国自80年代开始进行现代生物技术药品的研究和开发，虽然起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视，并列为“863”计划和国家重点攻关项目的主要内容，经过十多年的努力，特别是近五年来，现代生物技术医药产业有了突破性的进展，到1998年7月底我国已有十四种现代生物技术药品和疫苗投入生产，据初步统计，1997年的工业总产值约20亿(包括采用现代生物技术改造传统生物技术后新增加的产值在内)。
目前我国己有近200多个现代生物技术制药企业，其中约30家生产企业已具有不同规模的生产能力，陆续投入生产。因此，可以说我国现代生物技术制药产业化已经开始。
3. 单克隆抗体
3.1单克隆抗体的概念
抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞(浆细胞)和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
3.1单克隆抗体的主要特点
1)由于来于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸序列及空间构型上均相同;
2)由于抗体识别的是抗体分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此，单克隆抗体具有高度特异性; 3)产生该抗体的为一无性细胞系，且可长期传代并保存，为此可持续稳定的生产同一性质的抗体。
3. 2单克隆抗体的应用
作为亲合层析的配体:单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。
作为生物治疗的导向武器:脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。
作为免疫抑制剂:抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。
作为研究工作中的探针:单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。
增强抗原的免疫原性:抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。
作为医学检验试剂:单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下： (1)诊断各类病原体
这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。
(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测
用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。
随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。 (3)检测淋巴细胞表面标志 用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。
(4)机体微量成分的测定
应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义.
4实验方法
4.1材料
a.盐溶液：将NaCl8克，KClO4克，Na2HPO4·2H2O1.77克， NaH2P04·H
2O0.69克，葡萄糖2克，酚红0.001克，溶于1000ml双蒸水中，pH7.2。高压115℃，15分钟，保存于室温。
标准培养液;RPMI1640，DMEM或者Iscove‘s培养液，加入10%灭活血清(马血清、小牛血清或胎牛血清)，贮存于4℃。在使用前加入2%100×谷酰胺，1%100×丙酮酸钠，1%100 ×抗菌素(青霉素和链霉素各10000单位/m1)，0.05%0.1M硫乙二醇。所有培养液均需于两天内用完。 选择性培养液：即所谓HAT培养液，
100× HAT培养液，
100×H：Hypoxanthine次黄嘌呤为10mM，必须在45℃溶解完全。 100×A：Aminopterine氨基喋呤为0.04mM.必须在45℃溶解于稀释NaOH溶液中，然后再用HCI中和。
I00×T;Thymidime胸腺嘧啶，1.6mM，在室温中溶解。 然后各溶液分别除菌过滤，分装5m1一支，-20℃保存。
HAT和HT的营养液都必须在应用前配制，方法把100×贮存液按1%加入营养液即成。
细胞冻存液：为9份营养浓加入l份DMSO二甲基亚砜，混匀。此时细胞株必须生长良好[1]。 b、骨髓瘤细胞株
BALB/c小鼠骨髓瘤细胞株，经过克隆纯化P3×63Ag8(简称×63) 和其衍生株SP—2/0，SP—2/0不产生球蛋白，此两株细胞均为本研究所Dr、G、Kohler所培育，这些细胞株都适应于各种标准培养液以及2.5cm2和7.5cm2的塑料培养瓶，分别装入4ml或12ml营养液，通入气体为10%CO
2、7%O2和83%N2，37℃恒温培养。
4.2 方法
a、小鼠免疫
成年BALB/c小鼠各种性别均可，用流感病毒1000个血凝单位腹腔注射，作为首次免疫。7一12周后，再给200血凝单位病毒腹腔注射，作为加强免疫。
在加强免疫后4—5天，即可进行细胞融合，处死小鼠、无菌取脾，把脾细胞轻轻压入10m1的盐溶液中，然后把细胞悬浮液转入15ml离心管中，毛细管吹打，然后至室温中10分钟，让其自然下沉，吸出大约9ml上清液，不要搅动底下的沉淀块，然后用TURK溶液作白细胞计数。 b、腹腔内巨噬细胞的采取
把成年BALB/c小鼠处死，剥开腹部皮肤，用4—5ml的标准培养液或0.34M(=11.6%)的蔗糖溶液注入腹腔，用18号针头从耻骨联合处，直接插入，把针头朝向肝右叶上方，然后轻轻按摩腹部，再行吸出腹腔液体。每鼠可得1.5—3×105的巨噬细胞，这些细胞可收集于塑料管中，用任何一种标准培养液洗细胞，并于30分钟内用完。 c、大孔培养
24孔培养板，每孔可容2m1培养液，培养于37℃，含7%CO2/DA大气恒温箱中。湿度为85—95%。
换营养液时，分别以无菌巴氏吸管联接于吸引装置上，吸出大约lml的血营养液，然后用一个小口的25m1吸管，分别加入预热的新鲜营养液。
如果细胞长得很密，可以用2ml吸管吸出培养液，转种于小瓶中，一般1.5ml细胞悬浮液可接种25㎝2的小瓶，当小瓶中细胞长至单层时，即可转种至75cm2的瓶中。以后即可按转种骨髓瘤细胞的方法，维持杂交瘤细胞。 d、微量培养法 平底的微量培养板每孔可容纳0.25mI的培养液，细胞培养条件与24孔培养板相同。当细胞长待很密时，第一步可转入24孔培养板的二个孔中，加入1m1培养液，然后按24孔培养板处理。
5.结论
通过小鼠免疫培养，腹腔内巨噬细胞的采取，微量培养，大孔培养，可得到一定量的杂交瘤细胞，同时分析了实验的一些影响因素，结果如下。
(1).各次细胞融合结果的差别，只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。
(2).巨噬细胞对杂交细胞的作用，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。
(3).加入巨噬细胞的用量和时间，投入实验的脾细胞的量减少10倍，培养28天后，活细胞多于10的阳性孔。
(4).用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞，巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长
(5).限量脾细胞杂交试验可知脾细胞加入量为4×106时，结果较好，细胞融合数较多。
(6).骨髓瘤细胞株的比较中，选择合适的骨髓瘤细胞株(x63)，产生单克隆抗体的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。
(7).融合剂 PEG聚乙二醇的比较中，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应，但分子量太大阳性数也会有所下降。
(8).细胞融合温度的比较中，室温比常规的4℃和0℃往往结果较理想。
(9).各种营养液的比较，DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove` s营养液比其他培养液要更好些。
(10).不同细胞换液方案比较中，细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。
(11). 在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养，可知微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔。
4(12). 在无血清培养液中，所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛。
参考文献
[1]齐香君，现代生物制药工艺学[M]，化学工业出版社，2003.9 [2]甄永苏等，抗体工程药物[M]，化学工业出版社 ，2002.5 [3]李元等，现代工程药物[M]，化学工业出版社，2002.5 [4]张和君，单克隆抗体细胞免疫反应技术[M]，云南科技出版社，1985.2 [5]胡春艳，刘全忠. 单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J].
安徽预防医学杂志，2008，14( 2) :116-118.
[6]孙玮，张利宁. 噬菌体抗体库技术研究进展[J]. 山东医药，
2007，47( 14) :81-82.
[7]吴雯峰，王双，孙志伟. 噬菌体展示抗体库筛选技术研究进展
[J]. 生物技术通讯，2007，18( 3) :476-479.
[8]Shibasaki S. Development of platformtechnology using molecular display[J]. YakugakuZasshi，2009，129( 11) :1333-1340. [9]朱学泰，谢溱，马瑞君. 单克隆抗体制备技术研究进展[J]. 甘
肃科技，2005，21( 3) :108-109.
[10]郭长占. 转基因小鼠研究进展[J]. 中华微生物学和免疫学杂
志，2000，20( 3) :278-282.
[11]刘瑞振，张长弓，何琼，等. 抗人DcR3单克隆抗体的制备鉴定
及应用[J]. 免疫学杂志，2009，25( 1) :34-38.
单克隆抗体
一、单克性抗体的制备
1、免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生效应B淋巴细胞的过程。
2、将准备好的骨髓瘤细胞与效应B淋巴细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇或灭活的病毒。在聚乙二醇或灭活的病毒作用下，各种效应B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养 选择性培养的目的是筛杂交瘤细胞。在选择性培养基上未融合的骨髓瘤细胞、未融合的淋巴细胞，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞才能在选择性培养基存活，杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体
4、杂交瘤细胞的克隆化培养和抗体阳性检测。选择性培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。
5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内培养法和体外培养法。
(1)体内培养法;用注射器抽取腹水，从中可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。从培养液中获取所需要的单克隆抗体。
二、单克性抗体的特点
特异性强、灵敏度高、能大量制备
三、杂交瘤细胞的特点
杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体
四、单克隆抗体制备过程中有三个筛选过程
1、从脾脏中筛选出多种效应B细胞。
2、在特定的培养基中筛选杂交瘤细胞
3、进行克隆化培养和抗体阳性检测，筛选出能产生特定抗体并能无限增殖的杂交瘤细胞。
五、单克隆抗体应用的基本原理是：抗原——抗体的的特异性结合。
六、单克隆抗体的主要应用
1、作为诊断试剂：单克隆抗体最广泛的应用就是作为诊断试剂。由于单克隆抗体纯度高、特异强，能准确地识别抗原物质的细微差别，并能与一定抗原特异性结合。
2、用于治疗疾病和运载药物。把抗癌细胞的单克隆抗体放射性同位素、化学药物或细胞毒素结合制成生物导弹。利用抗原——抗体的的特异性结合，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在部位，在原位杀死癌细胞，不损伤正常细胞、药剂量少、疗效高、毒副作用小。
摘 要: 通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物 ,已经成为生物制药领域的一个重要方面 ,由于单克隆抗体药物专一性强、 疗效显著 ,因此成为近年来研究的热点药物之一。此文就单抗药物的分类、应用进行了综述 ,并对其应用前景及存在的不足作了概述。
关键词:单克隆抗体 抗体药物 靶向 联用
自 1975 年Koeh ler 和M ilstein 首先报道利用小鼠杂交瘤细胞制备单克隆抗体以来, 经过近 30 年的发展, 单抗技术在生命科学研究及医学实践方面作出了杰出的贡献, 已经成为了现代生物技术产业的支柱之一。
然而, 尽管单抗推动了生物诊断技术的革命, 但是在将单抗应用于人体疾病的治疗方面, 却在长时间内迟迟没有进展。早期的临床试验结果都不尽人意, 这是因为鼠源单抗应用于人体有许多限制]. 现今上市的单抗药物, 治疗的领域主要集中在肿瘤、 自身免疫疾病、 器官移植排斥及病毒感染等领域。由于单抗具有明确的作用位点, 与靶位点亲和力高, 而且通过改造的抗体其免疫原性大大减弱, 这些因素使得单抗在临床治疗中具有特异性强、 见效快、 副作用较低等优点, 因而单抗治疗有着广阔的前景。目前, FDA 批准上市的 17 个单抗药物中即有 8 个是用于治疗淋巴细胞肿瘤、 乳腺癌及结直肠癌等, 而在开发阶段的单抗也有一半以上是与治疗各种癌症相关。可以预见, 在未来几年来将有更多的治疗性单抗药物上市, 其市场份额将进一步扩大。
目前, 单抗类药物的市场销售逐年提升的年均增长幅度在20%以上, 表现强劲。 用于治疗非霍奇金淋巴瘤的单抗药物R ituxan 已成为世界第一的抗肿瘤药物, 2003 年销售为 14 . 89亿美元, 2002 年为 11 . 63 亿美元, 在 2002 年全球最畅销前 50位商标名处方药中排名 43 位。用于治疗关节炎的单抗药物Rem icade, 2002 年销售额为 12 . 97 亿美元, 当年全球药物销售排名第 37 位。2000 年世界单抗药物的销售额为 22 . 05 亿美元, 据F ro st&Sullivan 预测, 到 2003 年销售额将达到 47 亿美元。
下面就单克隆抗体药物的研究进展作一综述。
1单克隆抗体药物的分类
单抗药物一般分为:治疗疾病(尤其是肿瘤)的单抗药剂、 抗肿瘤单抗偶联物、 治疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。如:最早被美国 FDA批准用于治疗肿瘤的单抗药物利妥昔单抗;抗肿瘤单抗偶联物 ,或称免疫偶联物( Immunoconjugate) , 由单抗与有治疗作用的物质(如:放射性核素、 毒素和药物等)两部分构成 ,其中包括放射免疫偶联物、 免疫毒素、 化学免疫偶联物 ,此外还有酶结合单抗偶联物、 光敏剂结合单抗偶联物等。
2作为肿瘤治疗药剂的单克隆抗体药物
表1概括了近年来美国 FDA 批准上市的 5 个治疗肿瘤的单克隆抗体药物的基本情况 ,下面具体加以介绍。
2.
1利妥昔单抗 在自身免疫性疾病形成过程中 ,B 细胞起重要作用。CD20是前B细胞向成熟淋巴细胞分化过程中表达的表面抗原 ,参与调节B细胞的生长和分化。利妥昔单抗(美罗华)是一种针对 CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体 ,是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后可与 CD20 特异性结合导致 B 细胞溶解 ,从而抑制 B 细胞增殖 ,诱导成熟 B细胞凋亡 ,但不影响原始B细胞。它能通过介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC) 、 补体依赖的细胞毒性(CDC)作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应 ,包括抑制细胞生长 ,改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞[1 ]。
由于利妥昔单抗药物可以提高肿瘤细胞对化疗的敏感性 ,所以利妥昔单抗药物的优势就在于与其他治疗药物及治疗方式配合使用。临床研究表明美罗华单药或联合化疗治疗肿瘤具有良好的疗效和安全性 ,但还是存在一定的毒副作用。夏忠军等[2 ]进行的临床研究:34例确诊惰性淋巴瘤的患者接受含利妥昔的方案化疗 ,结果总有效率为 92. 3 % ,完全缓解率为60. 0 %。主要不良反应为骨髓抑制 ,其它不良反应包括恶心呕吐、 轻度脱发和肝功能受损等。张晓艳等[3 ]对 4例 CD20阳性非霍奇金淋巴瘤(NHL) 病人进行了5次利妥昔单抗联合自体外周血干细胞移植(APBSCT)的治疗研究 ,结果显示所有病人均对利妥昔单抗耐受良好 ,植入后在 8～11 d内达造血重建 ,表明利妥昔单抗联合APBSCT治疗 CD20阳性NHL 是一种耐受及效果良好的方法。
2.
2曲妥珠单抗
曲妥珠单抗为一种针对 HER22/ neu的重组人源化 IgG单克隆抗体 ,能特异性识别 Her22调控的细胞表面蛋白 HER22 ,使其通过内吞噬作用离开胞膜进入核体内 ,抑制其介导的信号转导 ,从而起到治疗肿瘤的作用。美国 FDA 于 1999 年批准其上市 ,2002年在我国上市。大量临床资料证实曲妥珠单用于乳腺癌的有效率为21 % ,而且它与化疗联合应用明显提高了生存时间[4 ]。据报道 ,欧洲曲妥珠单抗辅助治疗试验研究了曲妥珠单抗对 HER22 阳性伴有或不伴有淋巴结阳性的乳腺癌患者的疗效 ,其中 1 组给予 1 年的曲妥珠单抗治疗 ,另1组作为对照。曲妥珠单抗治疗 1 年组与对照组相比 ,复发风险减少了46 % ,两组的整体生存率无明显区别 ,说明曲妥珠单抗用于治疗辅助化疗后的 HER22阳性乳腺癌患者 ,明显延长了患者的无病生存期[5 ]。我国也对曲妥珠进行了临床研究 ,沈坤炜等[6 ]对 42 例 Ⅱ～ ⅢA期浸润性乳腺癌患者紫杉醇联合曲妥珠单抗治疗 24 周 ,结果单用新辅助化疗组完全缓解率为 26. 3 % ,在新辅助化疗联用曲妥珠单抗组为65. 2 % ,可见 ,对于 HER22 过表达的乳腺癌化疗联用曲妥珠单抗能显著提高完全缓解率。
2.
3阿伦珠单抗 阿伦珠单抗是人源化、 非结合型单抗 ,作用靶点为正常与异常B淋巴细胞的 CD52 抗原 ,CD52 广泛分布于正常的 B淋巴细胞、 T淋巴细胞、 单核细胞、 巨噬细胞和B 淋巴细胞及T淋巴细胞瘤细胞表面 ,在慢性淋巴细胞白血病细胞表面尤为丰富。它与带 CD52 的靶细胞结合后 ,通过宿主效应子的补体依赖性细胞毒性(CDC) 、 抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和细胞凋亡等机制导致细胞死亡。阿伦珠单抗作为一种作用机制独特的单克隆抗体 ,对源于B和 T细胞的各种恶性肿瘤具有很好的治疗作用。
英国科学家应用阿伦珠单抗和利妥昔单抗治疗复发性淋巴瘤患者 ,结果总反应率为 52 % ,其中完全缓解 8 % ,表明联合使用阿伦珠单抗和利妥昔单抗是安全可行的。在其它 T细胞恶性肿瘤的治疗中:对 22 例 Ⅲ～ Ⅳ期皮肤 T细胞淋巴瘤(蕈样肉芽肿病和 Sezary综合征)患者静脉输注阿伦珠 12周 ,结果显示阿伦珠具有非常好的疗效 ,总有效率达 55 %。其中 ,红皮病患者总有效率达 69 % ,片状斑或皮肤肿瘤患者达40 %[7 ]。阿伦珠单抗联合其他药物、 化疗等治疗肿瘤具有显著的效果。但临床研究表明 ,其还存在一些常见并发症 ,如低血压、 寒颤、 发热、 恶心、 呕吐、 气短、 支气管痉挛、 皮疹、疲乏、 呼吸困难、 头痛、 腹泻、 感染等。 2.
4西妥昔单抗
西妥昔单抗为 IgG 1 单克隆抗体 ,是表皮生长因子受体拮抗剂 ,可与表达于正常细胞和多种肿瘤细胞表面的表皮生长因子受体( EGFR)特异性结合 ,并竞争性阻断 EGF和其他配体 ,如α 2转化生长因子(TGF 2 α)的结合。它通过增加细胞周期抑制因子 p27kip 使得细胞周期停留在 G 1 期;增加 Bax表达和减少 bcl22表达 ,诱导癌细胞的凋亡;它还可减少基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子(VEGF)的产生。相关实验表明 ,西妥昔单抗可抑制过度表达 EGFR的肿瘤细胞的增殖 ,但是对缺乏 EGFR表达的肿瘤细胞则没有抗肿瘤效果 ,还发现西妥昔与化疗联用要优于单独化疗[8 ]。
在对西妥昔单抗联合化疗的研究中 ,BOAD 试验最为著名。576例晚期结直肠癌(ACRC)患者中 82 %的 EGFR 过表达。治疗采取两个方案 ,第1组用西妥昔单抗联合伊立替康治疗;第2组单独用西妥昔单抗单药治疗。西妥昔单抗联合伊立替康与单用西妥昔单抗相比 ,联用疗效优于单一使用 ,有效率分别为23 %和11 % ,疾病控制率为 56 %和 32 % ,疾病进展中位时间为4. 1和1. 5个月 ,中位生存时间为8. 6和6. 9个月 ,而且西妥昔单抗并没有增加化疗的副作用。以上临床实验显示:西妥昔单抗能够克服 ACRC患者对伊立替康的耐药性 ,生存质量明显提高[9 ]。西妥昔单抗的毒副作用包括:痤疮样皮疹、 虚弱、 腹痛、 恶心、 呕吐、 白细胞减少和过敏反应等。其中痤疮样皮疹是最常见的不良反应 ,皮疹主要分布在脸部和躯干上部 ,这可能是由于西妥昔单抗干扰了 EGF的表皮生理作用所致[10 ]。
2.
5贝伐单抗
贝伐单抗是抗VEGF的人源化单抗 ,主要通过中和VEGF来阻断其与内皮细胞上的受体结合 ,使得肿瘤细胞不能得到养分和氧 ,起到治疗肿瘤的作用。Presta 等[11 ]将鼠抗人VEGF单克隆抗体(muMAB VEGF) A. 4. 6. 1 的互补决定区与人 IgG 1的恒定区框架嵌合 ,并对相应氨基酸残基加以修饰 ,最终形成了人鼠嵌合型 VEGF单抗 ,仍然有 7 %的氨基酸来源于鼠抗体。实验表明 ,贝伐单抗用于治疗肿瘤安全有效。郑航等[12 ]探究贝伐单抗联合伊立替康治疗转移性结肠癌的疗效 ,90例患者中给予贝伐单抗联合伊立替康治疗的一组有效率为43. 3 % ,血清肿瘤标志物的浓度治疗前后有显著变化。这说明贝伐联合伊立替康治疗转移性结肠癌具有更高的疾病控制率。2005 年美国临床肿瘤学会年会上报道了贝伐单抗的最新研究结果 ,采用贝伐单抗联合伊立替康和顺铂一线治疗转移性胃癌或者胃食管连接部腺癌的患者 ,治疗的不良反应除了原有伊立替康和顺铂引起的肾髓抑制、 胃肠道反应等 ,还有贝伐单抗造成的不良反应包括栓塞性疾病、胃穿孔等。
3抗肿瘤单抗偶联物
3.
1放射免疫偶联物
放射免疫治疗(RIT)是以单克隆抗体为载体 ,以放射性核素为弹头 ,通过抗体特异性结合肿瘤细胞相关抗原 ,将产生高能射线的放射性核素靶向到肿瘤细胞 ,实现对肿瘤的近距离内照射治疗。RIT利用携带放射性核素的单克隆抗体特异地结合到病灶部位 ,减少了对正常组织的损伤。90Y— ibri2tumomab是第1个被 FDA批准应用于临床的放射免疫制剂 ,主要用于复发的淋巴瘤患者或对单独应用利妥昔单抗疗效不佳的患者。
3.
2免疫毒素
免疫毒素是用化学方法或基因工程方法将肿瘤选择性单抗与经修饰的多肽毒素共价连接而成的肿瘤治疗药物。免疫毒素可与肿瘤细胞表面受体或与细胞表面的靶抗原相结合后内化 ,继而在胞内抑制细胞蛋白质合成 ,导致肿瘤细胞死亡。毒素有很多种 ,如植物毒素、 细菌毒素、 动物毒素 , 其中引用最广泛的是植物毒素中的白喉毒素。美国 FDA已经批准了白喉毒素与白细胞介素 2 重组的免疫毒素 ONTAK(DAB3892I L2) ,用于治疗人皮肤 T细胞淋巴瘤[13214 ]。
3.
3化学免疫偶联物 单抗是药物良好的靶向性载体 ,通过药物分子上特殊的功能基团如:羟基、 巯基、 氨基等 ,将治疗药物与单抗相连接而组成化学免疫偶联物 ,避免了药物对其他正常组织的毒害作用,选择性地发挥治疗作用。常与单抗进行偶联的药物有阿霉素、 柔红霉素、 平阳霉素、 博安霉素、 丝裂霉素、 新制癌菌素、 氨甲喋呤等。
4单克隆抗体在其他疾病中的应用 单克隆抗体药物不只在肿瘤的治疗中取得了很好疗效 ,在其他疾病的治疗中也取得了一些疗效 ,例如:奥马珠单抗(omalizumab)通过与游离 IgE结合而显著降低游离 IgE的水平 ,阻断 IgE与肥大细胞、 嗜碱粒细胞结合 ,防止炎症介质的释放。可显著改善哮喘病人的症状、 肺功能及生活质量 ,减少哮喘恶化的发作次数 ,减少糖皮质激素的用量 ,使用安全 ,具有很好的耐受性[15 ]。Mab03. 2C1C2 在体外能抑制白念珠菌芽管的形成 ,从而抑制白念珠菌对上皮细胞、 内皮细胞的粘附 ,降低白念珠菌的侵袭力。利妥昔单抗对类风湿和系统性红斑狼疮也有很好的治疗作用。英夫利昔单抗对类风湿性关节炎患者疼痛、 晨僵、 关节肿胀等临床症状减轻程度就可达60 %。另有研究显示 ,输注英夫利昔单抗可快速、 显著缓解顽固性银屑病、 关节炎病人的关节和皮损症状[16 ]。英利昔单抗对克罗恩病、 溃疡性结肠炎、 酒精性肝病等消化系统疾病都有较好疗效 ,且在推荐的治疗范围内安全性良好[17 ]。
参考文献 [1 ] 冯洁.介绍几种抗肿瘤的靶向新药[J ] . 中国药师,2006 ,9 (2) :1762178. [2 ] 夏忠军.含美罗华方案治疗B细胞性惰性淋巴瘤34例报告[J ] .癌症,2006 ,25 (4) :4902494. [3 ] 张晓艳.利妥昔单抗联合自体外周血干细胞移植治疗非霍奇金淋巴瘤[J ] .中国新药与临床杂志,2006 ,7 (19) :5412544. [4 ] 吴凤霞. Herceptin—一种治疗乳腺癌的新药[J ] . 中国生化药物杂志,1999 ,20 (1) :47. [5 ] 董嵩,朱建权,吴一龙. 美国临床肿瘤学报告[J ] . 循证医学,2006 ,6 (2) :67273. [6 ] 沈坤炜.紫杉醇序贯表阿霉素新辅助化疗联合曲妥珠单抗显著提高病理完全缓解率[J ] .循证医学,2006 ,4 (6) :84286. [7 ] 崔银珠,胡江宁. 慢性淋巴细胞白血病治行新药 alemtuzumab[J ] .世界临床药物,2004 ,25 (5) :2922296. [8 ]
Baselga J . The EGFR as a target for anticancer therapy 2 focus on cetux2imab[J ] . Eur J Cancer 2001 ,37 (4) :16222.
[9 ]
Nygren P ,S orbye H O ,Sterlund P ,et al . Targeted drugs in metastaticcolorectal cancer with special emphasis on guidelines for the use of be2vacizumab and cetuximab : an Acta Oncologica expert report [J ] . ActaOncol ,2005 ,44 (3) :2032217.
[10 ] Busam KJ ,Capodieci P ,Motzer R ,et al . Cutaneous side2effects in can2cer patients treated with the anti epidermal growth factor receptor anti2body C225[J ] .Br J Dermatol ,2001 ,144 (6) :116921176. [11 ] Presta L G,Chen H ,C onnor S J ,et al . Humanization of an anti2vascularendothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of s olid tu2mors and other dis orders[J ] . Cancer Res ,1997 ,57 (20) :459324599.
[12 ] 郑航,陈锦章,廖吐军,等.贝伐单抗联合伊立替康治疗转移性结直肠癌的近期疗效观察[J ] . 南方医科大学学报,2006 ,2652269. [13 ] 冯仁田,何维.白细胞介素218 的研究进展[J ] .中国生化药物杂志,1999 ,20 (2) :1012103. [14 ] 裴瑾,杨成君,杨翰仪,等. 白细胞介素 2 脂质体的制备及其抗肿瘤作用的研究[J ] .中国生化药物杂志,1997 ,18 (4) :1662169. [15 ] 赵云峰,吴学玲,罗永艾.奥马珠单抗对支气管哮喘的治疗作用[J ] .中国新药与临床杂志,2005 ,24 (1) :68272. [16 ] 林金盈.生物制剂在风湿病治疗中的应用[J ] .广西医学,2006 ,28 (1) :528. [17 ] 陈垦.英利昔单抗在消化系统疾病中的应用状况及前景[J ] .中国医院用药评价与分析,2006 ,6 (3) :1512153.
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