高效液相色谱法测定论文

高效液相色谱法测定褪黑激素的含量@苏燕@叶传华$四川抗菌素工业研究所褪黑激素；ＨＰＬＣ褪色激素是人体松果腺体分泌的一种吲哚类激素，具有广泛的生理活性作用。今天小编为大家推荐《高效液相色谱法测定论文 (精选3篇)》，仅供参考，希望能够帮助到大家。

高效液相色谱法测定论文 篇1：

基于高效液相色谱法测定饮料中咖啡因分析

摘要：文章对基于高效液相色谱法测定饮料咖啡因的含量进行分析与探讨，首先对高效液相色谱法所需的材料试剂以及仪器设备配置情况进行初步分析，然后对实验结果进行系统分析与讨论，以验证本方法用于饮料样品中咖啡因含量测定的可行性，仅供参考。

关键词：饮料;咖啡因;高效液相色谱法

1 实验方法

实验所需材料与相关试剂均由XX生化科技股份有限公司提供，甲醇为HPLC级，浓度99.9%以上，其他相关试剂为分析纯。咖啡因标准溶液配制方法如下：精密称取一定剂量纯咖啡因溶液至标准容积为1000.ml容量瓶中，经超纯水定容至标准刻度，得到咖啡因标准储备溶液，充分混合均匀后静置备用。测定前取适量溶液至标准容积为100.0ml容量瓶中，逐级稀释并得到相应浓度标准的咖啡因标准使用液。饮料样品溶液先经0.22um水性微孔膜充分过滤，在此基础之上经高效液相色谱法直接分析，有需求的情况下对饮料样品进行稀释后分析。实验所需的相关设备仪器包括高效液相色谱仪，产品型号为LC-20AT，配置有SPD-20A紫外检测器以及自动进样器装置，进样体积为10.0uL，同时配置紫外分光光度计，设备型号为DR6000，检测波长区间为190～1100nm。

2 结果分析

1)流动相流速。以柱温35.0℃以及流动相比甲醇：水为1：1的情况下，对流动相流速相对于饮料样品中咖啡因保留时间以及色谱峰面积的影响情况进行考察与研究，进行3次平行实验并以平均值为参考值，形成如下图(见图1)所示曲线。结合图1可见，在流动相流速不断增加的情况下，与之相对应的色谱峰面积以及保留时间均呈现出下降趋势，色谱峰面积大，有较高的灵敏度，保留时间短且操作费用低。因此，经综合因素考量，在基于高效液相色谱法对饮料中咖啡因成分进行测定时，为确保分析灵敏度高，同时缩短分析时间，提升分析效率，建议将流动相流速控制为1.0ml/min。

2)柱温。在流动相比甲醇：水为1：1且流动相流速为1.0l/min的情况下，对柱温相对于饮料样品中咖啡因保留时间以及色谱峰面积的影响情况进行考察与研究，进行3次平行实验并以平均值为参考值，形成如下图(见图2)所示曲线。结合图2可见，在柱温升高的情况下，饮料样品中咖啡因保留时间呈现出反向下降关系。柱温升高意味着传质阻力得到明显改善，对提升柱效，增加灵敏度，缩短分析时间等均具有非常确切的效果。但与此同时，柱温过高的情况下会对整个高效液相色谱法的选择性产生影响，组分分离难度增加，且固定相有效成分可能发生流失，严重时还会导致色谱柱的损坏。因此，在基于高效液相色谱法对饮料中咖啡因成分进行测定时，为确保分析灵敏度高，提升分析效率，保护有效组分，建议将柱温控制为35.0℃。

3)精密度。对不同浓度的咖啡因溶液进行配置，不同浓度进行7次平行实验。以相对标准偏差表示方法精密度。实驗结果如下：A组7次测定值平均值为0.092mg/l，标准偏差为0.00126，相对标准偏差为1.37%;B组7次测定值平均值为0.45mg/l，标准偏差为0.00616，相对标准偏差为1.38%;C组7次测定值平均值为0.98mg/l，标准偏差为0.00707，相对标准偏差为0.73%;D组7次测定值平均值为1.88mg/l，标准偏差为0.01300，相对标准偏差为0.69%;E组7次测定值平均值为4.50mg/l，标准偏差为0.05356，相对标准偏差为1.19%;F组7次测定值平均值为9.41mg/l，标准偏差为0.03323，相对标准偏差为0.35%;G组7次测定值平均值为28.24mg/l，标准偏差为0.2668，相对标准偏差为0.94%;H组7次测定值平均值为46.11mg/l，标准偏差为0.4331，相对标准偏差为0.94%;I组7次测定值平均值为72.36mg/l，标准偏差为0.4600，相对标准偏差为0.63%;J组7次测定值平均值为92.92mg/l，标准偏差为0.10012，相对标准偏差为0.11%。结合以上数据可见，咖啡因相对标准偏差位于0.11%～1.38%区间范围内。

3 结束语

本文构建了基于反相高效液相色谱法对饮料样品中咖啡因含量进行测定的体系，通过试验的方式确定流动相速度以及柱温等反应条件，并对方法精密度进行验证，得到以下几个方面的结论：(1)在基于高效液相色谱法对饮料中咖啡因成分进行测定时，为确保分析灵敏度高，同时缩短分析时间，提升分析效率，建议将流动相流速控制为1.0ml/min;(2)在基于高效液相色谱法对饮料中咖啡因成分进行测定时，为确保分析灵敏度高，提升分析效率，保护有效组分，建议将柱温控制为35.0℃;(3)咖啡因相对标准偏差位于0.11%～1.38%区间范围内。

参考文献：

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[2]信建豪，邢建华，辛媛媛， 等.离心萃取-紫外光度法快速测定茶饮料中的咖啡因[J].湖北农业科学，2012，51(4)：810-812.

江苏实朴检测服务有限公司

作者：袁雪晴

高效液相色谱法测定论文 篇2：

反相高效液相色谱法测定人血清中奥卡西平活性代谢产物的浓度

[摘要] 目的 建立反相高效液相色谱法测定人血清中奥卡西平(OXC)活性代谢产物MHD的浓度。 方法 收集血清样品经甲醇沉淀蛋白后，采用InertSustain C18(5 μm，4.6×150 mm)色谱柱，流动相为甲醇-水(35：65)，流速：0.8 mL/min，检测波长：210 nm，柱温：40℃，进样体积：20 μL。 结果 血清中内源性物质对样品测定无干扰，MHD 在4.8～38.4 μg/mL线性关系良好，回归方程为：A=13968.3C-13730.7，r=0.9990。MHD的低、中、高3种浓度平均回收率均>95%，日内、间 RSD 均<3%(n=5)。 结论 反相高效液相色谱法简便、准确、灵敏度高，适用于人体内奥卡西平活性代谢产物MHD的血药浓度监测。

[关键词] 奥卡西平;10，11-二氢-10-羟基卡马西平;活性代谢产物;反相高效液相色谱法;血药浓度

Determination of active metabolites of oxcarbazepine in human serum by reversed-phase high performance liquid chromatography

GAO Yali ZHUANG Yiyun XU Qiuxia CHEN Xi

Department of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

[Key words] Oxcarbazepine;10， 11-dihydro-10-hydroxycarbamazepine;Active metabolites; Reversed-phase high performance liquid chromatography;Serum concentration

癫痫是一组由于脑部神经元异常过度放电所引起的突然、短暂、反复发作的中枢神经系统(central nervous system，CNS)功能失常的慢性疾病和綜合征[1]，是一类严重影响人类身心健康的神经系统疾病。目前，癫痫患者控制癫痫发作的最重要手段仍然是服用抗癫痫药物。奥卡西平(oxcarbazepine，OXC)是一种新型的抗癫痫药物，是卡马西平(carbamazepine，CBZ)的10-酮基衍生物(图1)，2000年1月由美国FDA批准上市。OXC不良反应的发生率显著低于CBZ[2]，且耐受性好，对肝药酶诱导作用较弱，药物相互作用少，可作为传统抗癫痫药的替代药物[3]。OXC在服用后，迅速且几乎完全地降解为药理活性代谢产物10，11-二氢-10-羟基卡马西平(monohydroxycarbazepine，MHD)(图2)。在人体进行的一项物质平衡研究中，OXC原型仅占血清中总放射活性的2%[4]，因此在临床上可通过测定血清中MHD血药浓度来判断OXC的疗效和不良反应。为了解MHD在体内的药动学特征和进行血药浓度监测，本研究参考国内外相关文献，简化血样前处理，优化色谱条件，建立了RP-HPLC法测定人血清中MHD浓度，为临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津LC-30AD高效液相色谱系统：包括DGU-20A5R脱气机、SIL-30AC自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-30A柱温箱、LC-30AD二元泵以及LC solution色谱工作站;XH-B型漩涡混合器(江苏康健医疗用品有限公司);离心机(10900/min，德国ABBOTT公司);METTLER AE240电子天平。

1.2 试剂与试药

奥卡西平片(商品名为曲莱，Novartis Pharma Schweiz AG，规格300 mg/片);MHD对照品(南京康满林生物医药科技有限公司，纯度约为96%，批号：20131227);甲醇(HPLC级，美国TEDIA公司);纯化水(本实验室自制);空白血浆(健康体检者的混合血浆);其他试剂为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：InertSustain C18(5 μm，4.6×150 mm);流动相：甲醇-水(35：65);流速：0.8 mL/min;二極管阵列检测器波长：210 nm;柱温：40℃;进样体积：20 μL。

1.3.2 对照品溶剂的配制 精密称取MHD标准品适量放在烧杯中，用少量甲醇溶解后转移至10 mL容量瓶中，用甲醇多次洗涤烧杯，并把洗涤溶液全部转移到容量瓶中，甲醇稀释至刻度，配制成0.96 mg/mL(此浓度经过纯度折算)的标准储备液，转移至棕色瓶后置冰箱4℃贮存。临用时，用甲醇稀释成浓度为96 μg/mL的工作液。

1.3.3 标准血清样品的制备及前处理 分别精密量取96 μg/mL的MHD工作液适量，用甲醇稀释得到含MHD 4.8、9.6、14.4、19.2、28.8、38.4 μg/mL标准工作液。精密移取空白血清200 μL置于1.5 mL EP管中，分别加入200 μL上述已配置好的不同浓度标准工作液，旋涡混匀1 min，加入600 μL甲醇，旋涡混匀1 min，10900 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm微孔滤器滤过，进样上机。

1.3.4 血清样品前处理 精密量取患者血清样品200 μL置于1.5 ml EP管中，加入800 μL甲醇沉淀蛋白，旋涡混匀1 min，10900 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm微孔滤器滤过，进样上机。

2 结果

2.1 方法的专属性

在选定的血样前处理方法和色谱分离条件下，得到空白血清(A)、空白血清加入MHD对照品(B)、患者服药后血样(C)的色谱图见图3。可见在本实验条件下MHD的保留时间为15.25 min，血清中内源性物质对MHD的测定无干扰，色谱峰形较好，分离完全。

2.2 标准曲线的制备

取含MHD的系列标准工作液，按“1.3.3”项下方法操作后，进样测定，记录色谱图。以样品峰面积(A)对质量浓度(C)作线性回归，得标准曲线回归方程A=13968.3C-13730.7，r=0.9990，结果表明血清中MHD在4.8～38.4 μg/mL线性关系良好。

2.3 方法回收率和精密度

分别精密量取96 μg/mL的MHD工作液适量，用甲醇稀释得到含MHD7.2、12、24 μg/mL低、中、高3种质控溶液，每个浓度平行配制5份，按“1.3.3”项下方法操作，进样分析，各浓度分别在同一日内测定，连续测定5 d。根据所得图形峰面积(A)代入相应的标准曲线中求得各样品浓度，以日内测得的实测浓度计算日内RSD，不同日测得的实测浓度计算日间RSD，以实测浓度与理论浓度的比值计算方法回收率。MHD的低、中、高3种浓度平均回收率均>95%，日内、日间RSD均<3%(n=5)，见表1。

2.4 临床应用

应用建立的RP-HPLC法测定OXC活性代谢产物MHD在体内的稳态谷浓度水平，测定时血中杂质无干扰。2016年1月～2017年12月共收集77例门诊及住院病例，其中在有效血药浓度范围内(《中国药典·临床用药须知·化学药和生物制品卷》(2010年版)推荐值为10～35 μg/mL[6])的占46.75%(36/77)，<10 μg/mL占53.25%(41/77)，最低为1.11 μg/mL，>35 μg/mL占0。结果显示OXC在按常规剂量给药的情况下，存在部分患者血药浓度在有效浓度范围外，因此，需要在血药浓度监测下调整给药剂量，本方法能够满足临床血药浓度监测，也能用于患者过量服药情况下的中毒药物浓度监测，从而为患者制定个体化用药方案。

3 讨论

从奥卡西平的药动学特征来看，口服OXC后，其活性代谢产物MHD一般在2～3 d内达到稳态血药浓度。本文对癫痫患者口服OXC片后进行TDM，在给药前采集血样测定人血清中MHD稳态谷浓度水平。MHD在人血清中的血药浓度测定方法已有文献报道，通常采用LC-MS/MS法[7]和HPLC法[8-16]。LC-MS/MS专属性强、灵敏度高，但由于成本昂贵，不适用于常规检测。目前国内关于MHD药物浓度测定的HPLC法大多采用内标法进行测定[9-11，16]，操作较为繁琐，本文采用外标法进行测定，实验结果表明该方法简便快捷，也能准确地测定MHD的血药浓度。

MHD结构中有两个苯环，具有明显的紫外吸收。本实验在200～360 nm的波长范围内进行紫外扫描，发现检测波长为210 nm时，基线平稳，吸收值较大，灵敏度较高，因此选取210 nm作为检测波长。采用甲醇-水为流动相，按照不同配比进行检测，发现甲醇-水(35：65)时，血清中内源性杂质对样品测定无干扰，色谱峰最为理想。血样预处理方法包括固相萃取法[8]、液液萃取法[9-12]和蛋白沉淀法[13-16]。固相萃取法费用较高，操作繁琐;液液萃取法处理具有易乳化、易造成过程污染、提取不完全等缺点。本文采用有机溶剂蛋白沉淀法，操作简便、快速、成本较低，通过对文献报道的测定方法进行改进，采用甲醇[14-16]沉淀蛋白，采集血清量少，试剂价廉，毒性低，离心后直接取上清液进样，色谱分离好，方法简便、准确、灵敏度高、重复性好，适用于临床血药浓度监测。

综上所述，抗癫痫治疗是一个长期的过程，我院目前開展奥卡西平的血药浓度监测，既是医生了解患者用药依从性的一种手段，同时也是医生监测患者治疗效果的一种方式，有助于医生针对个体癫痫患者调整用药方案，提高治疗效果，降低不良反应发生率。

[参考文献]

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(收稿日期：2017-11-28)

作者：高雅莉　庄奕筠　许秋霞

高效液相色谱法测定论文 篇3：

高效液相色谱法测定饮料中咖啡因

摘要：本文主要针对高效液相色谱法测定饮料中咖啡因中的含量进行了研究，其次阐述了高效液相色谱法在应用中的实验过程，并根据相应的实验结果展开了饮料中咖啡因的测定价值，希望为相关研究学者提供一定的参考依据。

关键词：高效液相色谱法;咖啡因含量;标准曲线;咖啡因

1.咖啡因简述

咖啡因是一种有机物质，能够从咖啡豆以及茶业等物质提炼的一种物质，它又称之为C8H10N4O2。现阶段，含有咖啡因的饮料被广大青少年所喜爱，但咖啡因的摄入过量会影响肝脏等功能的正常运行，同时也会影响人们的身体健康，孕妇使用会提升流产的几率，严重的情况会导致女性出现不孕不育。本文通过高效液相色谱法对饮料中咖啡因的含量进行了分析，并且可以得到有效的精准度。这一方法的应用操作便捷，并广泛的应用于饮料中的咖啡因含量工作。

2.咖啡因含量测定方法与分析方法

2.1传统测定方法

传统的测定方法主要通过萃取分光光度法进行饮料含量中的咖啡因测定，虽然有一定的简单性，但是在提取的过程中，会掺杂一定的杂质，因此，在检测过程中，最终的检测结果会出现较大的误差。如图1所示：

2.2高效液相色谱法

高效液相色谱法在进行饮料中咖啡因含量测定过程中，其主要优势在于可以有效的将咖啡因中的杂质以及单宁酸等物质进行有效的分离，在进行测定过程中，没有杂质的情况下，最终的测定结果会更加精准，但是在测定过程中必须要进行定量的精准操作。

3.高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量的实验

3.1实验设备和试剂

在进行饮料咖啡因含量测定过程中，高效液相色谱法实验在标准化实验室内进行。实验设备与仪器：型号为安捷伦1260检测装置、自动进样器、在线脱气装置、超纯水机设备，抽滤装置、天平、超声波脱气机、10、100毫升容量瓶以及烧杯等。试剂：咖啡因、东鹏特饮、甲醇试剂茶等。在选择实验设备以及试剂过程中要结合实际需求进行仪器设备的挑选，从而保证实验在进行过程中的顺利性。

3.2溶液配制

先配置磷酸盐缓冲液，其次配置1毫克的咖啡因标准储备液，最后在配置咖啡因标准溶液。在配置磷酸盐缓冲液过程中，利用二次次蒸馏水配置0.01摩尔的磷酸二氢钾溶液，最后在将其溶液的pH值调整到3.5左右。1毫克储备液的配置利用甲醇，并将其溶液定制到100毫升左右。最后在配置咖啡因标准溶液过程中，要将其配置成150微克、125微克、100微克、50微克以及25微克的咖啡因标准溶液，最后并对其进行超声脱气。

3.3样品处理

样品处理中，雪碧以及可乐中含有一定的碳酸。在进行处理过程中，首先要各取30毫升，并将其放在50毫升的烧杯内，在进行超声波脱气，其时间放置到15分钟左右，直至饮料中的二氧化碳消除。在加水，将原有的浓度稀释到1/10，在通过0.45微米的滤膜进行过滤，并将其做为实验检测的样本[1]。

3.4实验所需高效液相色谱条件

高效液相色谱中的流动性对于分离来说有一定的而影响，此次实验将已经配置好的摩尔磷酸盐缓冲液溶液进行过滤，在进行15分钟左右的脱气处理，并按照3：7的配比进行相应的配比，并制备500毫升的流动相。在进行检测过程中，按照色谱中的要求进行相应的调整，并检测磷酸盐、甲醇，其溶液的每分钟流速为1毫升左右。最后在进行高效液相色谱仪，并将其基础线一直处于平直状态。

3.5绘制标准曲线

当高效液相色谱仪中的基线达到平稳之后，在每20微升中的浓度設定相应的咖啡溶液，按照一定的顺序分别进样三次，直至其每个进样色谱中的面积相同，通过相应的测试将其记录下来，并在此基础上绘制相应的曲线图[2]。

3.6加样回收率实验

在进行实验过程中，将每毫升含量50毫克以及100毫升的咖啡因标准溶液分别添加到不含咖啡因的饮料中，并根据实验处理方法计算出实际空白的咖啡浓度中，最后在计算出空白介质中的咖啡因含量浓度，根据计算结果显示，实验中的误差范围在接受的范围内，其中空白介质中咖啡因浓度分别是每毫升50.5微克、每毫升100.24微克，回收率分别是101%、100.2%。

3.7各样品中咖啡因含量的测定

在进行样品测样分析时，要按照原有的时间找到咖啡因中的对应色谱峰，并记录好各个时间段的峰面积。在测定过程中，要反复将其进样三次，直到每次的峰面积达到一致后，在进行相应的数据统计。最后根据咖啡因中的溶液标准计算出样品中的咖啡浓度，并根据相应的稀释倍数将咖啡因中的浓度计算出来。

结论

综上所述，高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量测量在应用中具备一定的高效性，同时在进行检测中，具备较高的敏捷度和灵敏度，因此，在测量饮料中咖啡因的含量时一般采用高效液相色谱法进行操作，同时在应用中具备较好的实用价值，并为人们的身体健康提出了一定的安全保障。

参考文献

[1]曾延灵，朴杰，全春梅.超高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量[J].食品安全质量检测学报，2018，9(21)：5721-5724.

[2]李花觉.超高效液相色谱法检测饮料中山梨酸、苯甲酸、糖精钠、咖啡因、安赛蜜[J].现代食品，2018，11(21)：137-139.

作者：钟颖