目前临床对于I期非小细胞肺癌术后是否化疗仍存在较大争议, 多数学者均认为[1], 微转移是一个影响预后的独立因素[1], 而目前临床TNM分期仍未将微转移作为一个分期的指标, 因此, 为探讨微转移患者个体化化疗效果, 该院对2009年6月-2012年12月收治的78例Ⅰ期NSCLC且有微转移患者的石蜡包埋肿瘤标本进行肺癌组织ERRC1及CK免疫组化检测, 并进行术后个体化化疗以期改善这部分患者的预后, 现将研究过程与结论报道如下。
选取该院收治的经胸外科根治手术 (肺叶或全肺切除、系统性淋巴结清扫术) 且经常规病理检查存在微转移的I期NSCLC患者[2], 共78例, 男性48例, 占61.5%, 女性30例, 占38.5%, 年龄39～71岁, 平均年龄 (55.8±13.6) 岁。病理分型:鳞癌38例 (48.7%) , 腺癌29例 (37.2%) , 腺鳞癌11例 (14.1%) ;吸烟史:无吸烟史42例 (53.8%) , 3年以下19例 (24.4%) , 3年及以上17例 (21.8%) 。
将石蜡包埋组织标本置于-4℃冰箱内, 冷冻后取出, 制成2张组织薄片, 厚度均为5μm, 将其置于多聚赖氨酸处理过的载玻片上, 经摊片、烤片后进行CK免疫组织化学染色。2.1.2免疫组织化学染色步骤 (1) 采用常规脱蜡法将石蜡切片水化; (2) 将30%H2O21份与蒸馏水10份混合, 室温放置5～10 min以灭活内源性酶, 灭活后使用蒸馏水清洗3次; (3) 将切片浸入0.01 mol枸橼性酸盐缓冲液中, 微波炉加热至沸腾后停止, 每隔10 min重复一次, 共计2次。待切片冷却后, 使用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤2次; (4) 滴加5%双 (三甲基硅基) 乙酰胺 (BSA) 封闭液, 室温静置20 min后甩去多余液体, 无需洗涤; (5) 滴加稀释的一抗, 37℃静置1 h后, 使用PBS洗涤3次, 每次2 min; (6) 滴加生物素化二抗, 于室温下静置20 min后使用PBS洗涤3次, 每次2 min; (7) 滴加试剂SABC, 20～37℃静置20 min后使用PBS洗涤4次, 每次5 min; (8) DAB显色:取1 mL蒸馏水, 分别添加加试剂盒中A, B, C试剂各1滴, 混匀后加至切片, 室温显色, 镜下控制反应时间在20 min左右, 反应完毕后使用蒸馏水洗涤; (9) 苏木素轻度复染[3];脱水, 透明, 封片, 待检。
阳性结果为细胞膜及细胞浆出现棕黄色显色, 且切片中出现1例CK染色阳性的细胞, 则认为结果呈阳性, 即淋巴结中有微转移灶的存在。
鼠抗人ERCC1单克隆抗体由上海长岛生物技术有限公司提供。 (1) 石蜡切片经常规脱蜡水化后, 使用3%的H2O2温育20 min, 以灭活其内源性过氧化物酶, 使用蒸馏水洗涤3次, 每次洗涤时间约为5 min; (2) 微波抗原修复约5 min, 使用0.1 mol/LPBS洗涤3次, 每次5 min; (3) 滴加正常血清封闭液, 室温温育30 min后将多余液体倒出; (4) 滴加1∶80鼠抗人ER-CC1单抗 (稀释倍数1∶100) , 37℃1 h, 4℃冰箱放置8～12 h; (5) 0.1 mol/LPBS洗涤5 min, 3次; (6) 滴加生物素化二抗, 37℃环境下静置60 min; (7) 0.1 mol/LPBS洗涤5 min, 3次; (8) 滴加试剂SABC, 37℃, 60 min, 使用0.1 mol/LPBS洗涤5 min, 3次; (9) DAB显色5 min; (10) 苏木素复染, 脱水, 二甲苯透明, 中性树脂封片, 待检。
ERCC1主要呈细胞核染色, 在400×视野下, 对1000个肿瘤细胞中阳性细胞数予以记录。参照Wachters等[4]的方法来分析免疫组化ERCC1的表达水平, 即阴性表达 (-) :不表达或阳性细胞数<10%;阳性表达 (+) :视野中阳性细胞>10%。按照其表达程度分为阴性组和阳性组, 以进行分组治疗。
ERCC1阳性患者 (阳性组) 用不含铂方案, ERCC1阴性患者 (阴性组) 用含铂方案化疗[5]。
统计I期非小细胞肺癌微转移率, ERCC1阳性率及总体3年复发率、转移率及存活率。
对本临床研究的所有数据采用SPSS13.0进行分析, 对计数资料采用χ2检验, 对计量资料采用t检验, 检验水准设定为a=0.05, 当P<0.05时, 认为差异有统计学意义。
全部患者CK检测均为阳性, 阳性率100.0%。
对患者行ERRC1检测, 显示ERRC1阴性表达 (低表达) 者42例 (53.8%) , 纳入阴性组, ERRC2阳性表达 (高表达) 者36例 (46.2%) , 纳入阳性组;2009年6月—2010年12月, 共有235例Ⅰ期NSCLC患者在该院就诊, 经治疗及CK检测阳性确定微转移患者共78例, 转移率33.2%。见表1。
阳性组3年复发18例, 转移30例, 生存率61.1%, 阴性组复发20例, 转移34例, 生存率69.0%, 两组患者复发、转移、生存率比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一, 发病率和死亡率均已高居各类癌症死亡率之首。而肿瘤出现淋巴结微转移一般无明显临床表现, 常规影像学及临床病理学检查不易发现。而多数肺癌患者在手术前已经存在区域淋巴结或骨髓、外周血微转移灶, 造成病死率居高不下。因此, 探讨检测微转移灶的新方法, 补充完善病理TNM分期系统, 对选择适宜的综合治疗方法及延长其生存期均具有重要意义。2008年NCCN《非小细胞肺癌指南》[6]指出, IA期病变不需化疗, IB期病变不推荐化疗, 但为提高患者预后, 保证其生活质量及生存率, 我们认为, 应根据患者指标进行个体化治疗, 遂设计了本次探究。
CK是一种分化特异的蛋白质, 是组成细胞骨架的蛋白质之一, 广泛存在于人体上皮组织中, 而不存在于间叶组织中。但当细胞出现癌变时, 上皮性肿瘤可表达CK, 且间叶组织仍不表达, 因此, 可认为肺癌患者淋巴结中检测到CK可指示肿瘤微转移的出现。本例采用该理论, 确诊78例CK阳性微转移患者, 总体Ⅰ期NSCLC转移率为33.2%, 与Kim KS等[7]研究结果相仿, 结果可靠。
ERCC1是一类重要的核苷酸外切修复酶, 肺癌患者体内ERCC1一般呈现低表达, 而高表达往往与铂类制剂耐药相关;铂类是NSCLC化疗的基本药物, 通过分析患者基因表达水平以及遗传状态, 对设计是否选择含铂方案治疗及预测铂类药物疗效均具有指导意义, 而且能够在一定程度上避免药物相关的严重毒副作用风险, 从而使病人接受真正的个体化治疗。目前, 肺癌的分子分期及个体化治疗是肺癌研究领域的难点和热点, 本例根据患者ERCC1表达差异制定不同的化疗方案, 即ERCC1阳性患者用不含铂方案, ERCC1阴性患者用含铂方案化疗, 最终阳性组复发率50.0%, 转移率83.3%, 生存率69.4%, 而阴性组复发率47.6%, 转移率81.0%, 生存率73.8%, 两组组间数据比较无明显差异, 而通过对其他研究结论的对比分析[8], 我们发现, 经个体化治疗后, 患者复发率、转移率无明显变化, 而生存率较传统治疗方案上升约10%, 说明检测上述指标并进行合理化治疗可有效提高患者的生存期, 能够为Ⅰ期NSCLC患者的术后化疗提供可靠的临床指导。
综上所述, ERCC1和CK检测有助于客观评价患者预后, 合理应用多学科综合治疗, 避免不必要的医疗资源的浪费, 具有巨大的经济和社会效益, 值得广泛推广。
摘要：目的 探讨Ⅰ期非小细胞肺癌 (Non-Small Cell Lung Carcinoma, NSCLC) 的术后个体化化疗, 以提高肺癌的远期疗效。方法 对该院2009年6月—2012年12月收治的78例Ⅰ期NSCLC且有微转移患者的石蜡包埋肿瘤标本进行肺癌组织ERRC1 (excision repair cross-complementation group 1) 及细胞角蛋白 (Cytokeratin, CK) 免疫组化检测, 并进行术后个体化化疗, 分析上述指标表达对患者化疗反应率及生存率的关系, 探讨其对指导术后化疗的意义。结果 全部患者CK检测均为阳性, 阳性率100.0%;ERRC1阴性表达者42例 (53.8%) , ERRC2阳性表达者36例 (46.2%) ;2009年6月-2012年12月, 共有235例Ⅰ期NSCLC患者在该院就诊, 经治疗及CK检测阳性确定微转移患者共78例, 转移率33.2%;阳性组3年复发18例, 转移30例, 生存率61.1%, 阴性组复发20例, 转移34例, 生存率69.0%, 两组患者复发、转移、生存率比较均无明显统计学差异。结论 ERCC1和CK检测有助于客观评价患者预后, 合理应用多学科综合治疗, 避免不必要的医疗资源的浪费, 具有巨大的经济和社会效益, 值得广泛推广。
关键词：ERRC1,细胞角蛋白,Ⅰ期非小细胞肺癌,表达,化疗,指导
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