肝细胞生物学论文提纲

论文题目：基质硬度对肝细胞生物学行为和力学特性的影响

摘要：肝纤维化是多种病因引起的慢性肝损伤所致的病理改变,表现为肝内的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）成分过度沉积,基质硬度增加,并影响肝脏功能,是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段。研究发现,肝细胞在肝纤维化进程中扮演重要角色,其凋亡、异常迁移和力学信号转导可启动、参与肝纤维化进程。然而,目前对于基质硬度变化与肝细胞功能的关系尚不明确,相关机制也不甚清楚。因此,本课题以肝细胞为研究对象,基质硬度为研究条件,在二维/三维（2D/3D）尺度下探索不同基质硬度对肝细胞生物学行为和力学特性的影响及其机制,主要研究内容和结果如下:（1）不同基质硬度作用下肝细胞的转录组测序（RNA-Seq）及生物信息学分析采用化学交联法制备了硬度可调节的2D聚乙烯醇（polyvinyl alcohol,PVA）水凝胶基质,用于构建体外细胞培养模型,实验所用软（Soft）、中（Moderate）、硬（Stiff）三种基质硬度分别模拟正常肝组织、肝纤维化早期和晚期肝组织硬度。实验结果显示不同硬度PVA基质表面生长的肝细胞,状态良好,凋亡率低,同时可获得高质量的核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）并用于RNA-Seq检测及生物信息学分析。对测序获得的差异表达基因进行基因分类和信号通路富集分析,结果显示不同基质硬度影响肝细胞生长、细胞凋亡坏死、细胞肌动蛋白骨架重排、细胞间连接、细胞-基质互作、上皮-间质表型转换等生物功能和信号通路;通过实时定量PCR（qRT-PCR）对相关差异表达基因进行验证,基因定量结果与测序结果基本一致,提示RNA-Seq结果准确度较高,具有参考意义;参考生物信息学分析的结果,下一步从实验水平考察不同2D基质硬度对肝细胞功能的调控及机制。（2）不同2D基质硬度对肝细胞生物学行为和力学特性的影响及机制借助于（1）中构建的硬度可调节的体外细胞培养平台,探究2D不同基质硬度对肝细胞形貌、凋亡坏死、迁移性能和力学特性的影响及机制。结果显示,Stiff组可促进肝细胞骨架重排、伪足产生及细胞极化;显著性上调骨架相关蛋白F-actin和α-tubulin的表达,显著性下调肝细胞功能标志蛋白Albumin的表达;Stiff组可诱导β-连环蛋白（β-catenin）入核,进而显著上调肝细胞的死细胞比例,提示肝纤维晚期的病理硬度,可损害肝细胞功能、诱导肝细胞凋亡。基质硬度与裱衬蛋白浓度对单个肝细胞的迁移能力具有两相调节作用,实验浓度范围内,裱衬有0.01mg/m L纤连蛋白（fibronection,FN）的Soft组上生长的单个肝细胞具有最大的迁移轨迹、位移和速度;对融合肝细胞而言,细胞的迁移性能受基质硬度和时间共同调节,短时间内（6 h）,Soft组融合肝细胞迁移能力显著增强,长时间段内（48 h和72 h）,Stiff组迁移能力显著上调。基质硬度调控单个和融合生长肝细胞的杨氏模量和单个生长细胞的应力分布,原子力显微镜（atomic force microscope,AFM）检测的融合生长肝细胞的杨氏模量高于单个生长肝细胞,Moderate组肝细胞具有最大杨氏模量;对Soft和Moderate组进行有限元三维细胞模型分析的结果显示,在相同均布力作用下,Soft和Moderate组细胞应力分布相似,边缘位置具有较大应力分布,且Soft组最大Mises应力显著高于Moderate组。体内外水平研究表明,不同基质硬度可通过β-catenin介导的细胞-细胞间连接和整合素-β1（Integrin-β1）介导的细胞-基质间连接两大系统的平衡互作,实现对细胞杨氏模量的调节,Moderate组细胞杨氏模量最大,认为Moderate组基质的硬度,较Soft和Stiff组而言,更为接近两大黏附系统平衡的临界值,在临界值硬度的基质上,细胞具有最大杨氏模量。（3）不同3D基质硬度对肝细胞生物学功能的影响在（2）的研究基础上,进一步探究3D基质硬度对肝细胞生物学功能的影响,三种硬度分别与（2）中硬度相对应;结果表明,3D-Stiff组显著性上调肝细胞的死细胞比例;3D不同基质硬度对肝细胞的迁移无显著影响。与2D中的结果类似,3D-Stiff组可诱导β-catenin蛋白进入细胞核内,调控下游基因表达。本部分结果提示,3D-Stiff基质模拟的肝纤维化晚期病理硬度可通过诱导肝细胞的凋亡加剧肝纤维化疾病进程;同时,3D-Stiff可诱导激活β-catenin的入核信号通路,为后续研究3D基质硬度调节肝细胞凋亡坏死、迁移行为和力学特性变化的深入机制指明方向。综上所述,本文成功构建了模拟正常肝组织、肝纤维化早期和晚期肝组织硬度的体外细胞培养模型;发现了2D/3D Stiff基质可能通过调控肝细胞骨架重排、极化、下调肝细胞功能标志蛋白表达、上调肝细胞凋亡和迁移,参与肝纤维化疾病进程,并初步证实Integrin-β1和β-catenin所介导的细胞-基质间连接和细胞-细胞间连接的平衡互作,参与了不同基质硬度对肝细胞力学特性变化的调节。本文的研究结果有助于深入认识基质硬度通过肝细胞功能调节,影响肝纤维化疾病进程的重要地位;同时从力学生物学的角度为临床肝纤维化的治疗提供新的研究视角和思路。

关键词：基质硬度;肝细胞;细胞力学特性;力学生物学;肝纤维化

学科专业：生物医学工程

中文摘要

英文摘要

部分英文缩写表

1 绪论

1.1 问题的提出及研究意义

1.1.1 问题的提出

1.1.2 研究意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1 肝纤维化与基质硬度

1.2.2 肝细胞与肝纤维化

1.2.3 基质硬度对细胞行为的影响

1.3 研究目的及主要内容

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究内容及技术路线

1.4 创新点

2 不同基质硬度作用下肝细胞转录组测序及生物信息学分析

2.1 引言

2.2 试剂与材料

2.2.1 实验仪器及耗材

2.2.2 实验试剂

2.2.3 实验试剂的配置

2.3 实验路线及实验方法

2.3.1 实验路线

2.3.2 不同硬度PVA水凝胶基质的制备及表征

2.3.3 PVA基质对肝细胞细胞相容性影响

2.3.4 RNA提取和质量检测

2.3.5 RNA-Seq实验流程和生物信息学分析流程

2.3.6 qRT-PCR验证

2.3.7 统计学分析

2.4 实验结果

2.4.1 不同硬度PVA水凝胶基质的力学性能

2.4.2 不同硬度PVA水凝胶基质的微观结构和亲水性

2.4.3 不同基质硬度对肝细胞细胞相容性的影响

2.4.4 真核转录组测序质控分析

2.4.5 不同基质硬度对肝细胞基因表达的差异分析

2.4.6 不同基质硬度对肝细胞表达差异基因的聚类分析

2.4.7 差异基因的GO功能和Pathway显著性富集分析

2.4.8 qRT-PCR验证结果

2.5 分析与讨论

2.6 小结

3 不同2D基质硬度对肝细胞生物学行为和力学特性的影响

3.1 引言

3.2 试剂与材料

3.2.1 实验动物

3.2.2 实验仪器及耗材

3.2.3 实验试剂

3.2.4 实验试剂的配置

3.3 实验路线及实验方法

3.3.1 实验路线

3.3.2 不同基质硬度对肝细胞形貌和表型影响

3.3.3 不同基质硬度对肝细胞活/死细胞影响

3.3.4 不同基质硬度对肝细胞迁移影响

3.3.5 不同基质硬度对肝细胞力学特性影响

3.3.6 体内外水平研究不同基质硬度对迁移和力学特性影响的机制

3.3.7 统计学分析

3.4 实验结果

3.4.1 不同基质硬度影响肝细胞形貌和表型

3.4.2 不同基质硬度对肝细胞活/死细胞影响

3.4.3 不同基质硬度和不同裱衬蛋白浓度调控肝细胞迁移行为

3.4.4 不同基质硬度影响肝细胞力学特性

3.4.5 不同基质硬度上细胞三维模型构建和应力应变分布

3.4.6 体内外探究不同基质硬度对肝细胞迁移和力学特性影响的机制

3.5 分析与讨论

3.6 小结

4 不同3D基质硬度对肝细胞生物学功能的影响

4.1 引言

4.2 试剂与材料

4.2.1 实验仪器及耗材

4.2.2 实验试剂

4.3 实验路线及实验方法

4.3.1 实验路线

4.3.2 3D不同基质硬度内细胞培养

4.3.3 肝细胞的活/死细胞检测

4.3.4 3D基质内的细胞迁移实验

4.3.5 免疫荧光

4.3.6 统计学分析

4.4 实验结果

4.4.1 不同3D基质硬度对肝细胞活细胞/死细胞的影响

4.4.2 不同3D基质硬度对肝细胞骨架的影响

4.4.3 不同3D基质硬度对肝细胞迁移行为的影响

4.4.4 不同3D基质硬度对细胞β-catenin和Integrin-β1表达的影响

4.5 分析与讨论

4.6 小结

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 后续研究展望

致谢

参考文献